Dna聚合酶的机理

DNA聚合酶使用单一活性位点催化DNA合成

DNA的合成是由一种叫做DNA聚合酶的酶催化的。与大多数酶不同的是，它们有一个活性位点专门用于单一反应，DNA聚合酶使用一个活性位点来催化四种脱氧核苷三磷酸中的任何一种的加成。DNA聚合酶交流通过利用A:T和G:C碱基对整齐相同的几何结构来实现这种催化的灵活性(记住DNA螺旋的尺寸在很大程度上与DNA序列无关)。DNA聚合酶监测进入的核苷酸形成A:T或G:C碱基对的能力，而不是检测进入活性位点的确切核苷酸(图8-3)。只有当一个正确的碱基对形成时，引物的3'OH和进入的核苷三磷酸的«-磷酸才处于催化发生的最佳位置。不正确的碱基配对会导致核苷酸加成率显著降低，因为这些底物的催化排列不利(见图8-3b)。这是一个动力学选择性的例子，在这种情况下，只有当正确的底物存在时，酶才会通过显著增加键的形成速率，从而有利于使用几种可能底物中的一种进行催化。事实上，一个错误核苷酸的合并速度比碱基配对正确时的合并速度要慢10,000倍。

DNA聚合酶显示出一种令人印象深刻的能力，以区分ribo-和脱氧核糖苷三磷酸。尽管rntp在细胞中的浓度大约是dntp的10倍，但它们被吸收的速度比dntp低1000多倍。这种区分是由rNTPs从DNA聚合酶活性位点的空间位阻所介导的(图8-4)。在DNA聚合酶中，核苷酸结合袋太小，不允许2'OH在进入的核苷酸上存在。这个空间被两种使范勒瓦尔斯与糖汀接触的氨基酸所占据。有趣的是，将这些氨基酸改为侧链更小的其他氨基酸(例如，将谷氨酸改为丙氨酸)会导致一个DNA聚合酶明显减少了dntp和rtp之间的区别。

正确的碱基对b错误的碱基对模板A正确的碱基对模板

错误的碱基对

图8-3 DNA聚合酶催化核苷酸加成需要正确配对的碱基，(a)引物3'OH端攻击正确碱基配对的dNTP示意图(b)错误碱基配对对DNA聚合酶催化的后果示意图。在所示的例子中，不正确的AA碱基取代了进入核苷酸的u-磷酸基。这种不正确的合成大大降低了催化速率，导致DNA聚合酶优先!/添加正确的碱基配对dntp{来源基于Brautigan CA.和Steitz TA 1998。晶体结构提供了结构和功能的见解DMA聚合酶结构生物学8:SO，图4,d部分版权所有©199S, Elsevier授权)

一个模板

底漆

DNA聚合酶

图8-3 DNA聚合酶催化核苷酸加成需要正确配对的碱基，(a)引物3'OH端攻击正确碱基配对的dNTP示意图(b)错误碱基配对对DNA聚合酶催化的后果示意图。在所示的例子中，不正确的AA碱基取代了进入核苷酸的u-磷酸基。这种不正确的合成大大降低了催化速率，导致DNA聚合酶优先!/添加正确的碱基配对dntp{来源基于Brautigan CA.和Steitz TA 1998。由DMA聚合酶的晶体结构提供的结构和功能的洞察Curt Opin结构生物学8:SO，图4,part d.版权所有©199S与Elsevier许可)

图8-4阻止DNA聚合酶使用rNTPs催化的空间限制示意图(a)正确的碱基配对的dNTP与DNA聚合酶结合。在这些条件下，引物的3'OH和dNTP的<*-磷酸基非常接近，(b) 2'OH的加入导致茎:与核苷酸结合囊内的氨基酸(区分氨基粒)发生冲突。这导致dNTP的所有顺磷酸基被取代，并与引物的3'OH醇错位，大大降低了催化速率。

一个模板底漆

DNA聚合酶

DNA聚合酶就像一只握住引物的手:模板连接

对分子的理解DNA聚合酶催化DNA合成是通过对结合于引物的各种DNA聚合酶的原子结构的研究而产生的:模板连接。这些结构揭示了DNA底物位于一个大的裂缝中，类似于一个部分闭合的右手(图8-5)。根据与手的类比，聚合酶的三个区域被称为拇指、手指和手掌。

手掌结构域由p片组成，包含催化位点的主要元素。特别是，DNA聚合酶的这一区域结合两个二价金属离子(典型的mgmt:;或zn，改变正确的碱基配对dNTP和引物3'QH周围的化学环境(图8-6)。一个

图8-5 DNA聚合酶的三维结构类似于右手，(a) DMA聚合酶与引物模板连接的示意图。注意手指、拇指和手掌。最近合成的DNA与手掌有关，DNA催化位点位于手指和活拇指之间的缝隙。模板链的单链区域急剧弯曲，不通过拇指和平指之间，{b)与DNA结合的17个DNA聚合酶的类似视图。DNA以一种填充的方式显示蛋白质如图所示，手指和拇指是由螺旋形组成的。进入的dlW1显示为红色(为碱基和脱氧核糖)和黄色(为三磷酸盐部分)。DNA的模板链显示为深灰色，引物链显示为浅灰色。(Doubtie S-， Tabor S " l ong AM, Richardson CC, Elfenberger T 1998。Nature 391: 251)用BobScript, MolScnpt和Raster 3D制作的图像。

底漆

图8-6两个与DNA聚合酶结合的金属离子催化核苷酸加成。

(a) DNA聚合酶活性的图解。两个金属离子(绿色部分)通过与两个高度保守的天冬氨酸残基相互作用保持在原位。金属离子A主要与tl^ e3 ' oh相互作用，导致O和H之间的联系减少，这就剩下了一个裸色的3'0。金属离子B与进入dNTP的三磷酸相互作用，中和它们的负电荷。催化后，焦磷酸盐产物通过与金属离子B的类似相互作用(未显示)稳定下来。(b)活性位点金属离子与DNA聚合酶、引物的3'OH端和进入的核苷酸的三维结构。金属离子用绿色表示，其余元素用相同的颜色表示，如图8-5b所示。这里显示的聚合酶的vtew大致相当于将图8-5b所示的图像绕DMA螺旋轴旋转180°(Doublie S,r Tabor S.， Long AM..)理查德森和艾伦伯格，1998年。Nature 391 251)用BobScript编写的图像。MdSaipt和Raster 3D。

金属离子降低了3'OH对氢的亲和力。这会产生一个3fO”，为进入的dNTP的a-phns-phate的亲核攻击做好准备。第二种金属离子协调dNTP和-y-磷酸盐的负电荷，稳定焦磷酸盐生产者!通过连接引物和进入的核苷酸，除了催化作用外，手掌结构域还监视最近添加的核苷酸的碱基配对的准确性。聚合酶的这一区域与新合成DNA的小沟槽中的碱基对形成广泛的氢键接触。这些接触不是碱基特异性的，只有在最近添加的核苷酸(无论它们是什么)正确碱基配对的情况下才会形成。这一区域的DNA不匹配显著减缓了催化速度，催化速度放缓和对新合成DNA亲和力降低的结合使得引物模板从聚合酶活性位点释放，并与聚合酶上的一个独立校对核酸酶活性位点结合。

手指的作用是什么?拇指?手指对催化也很重要。位于手指内的几个残基与传入的dNTP结合。更重要的是，一旦在传入的dNTP和模板之间形成了正确的碱基对，手指域将移动以包围dNTP(图8-?})。这种封闭形式的聚合酶手通过移动进入的核苷酸与催化金属离子的密切接触来刺激催化。

手指结构域也与模板区域相结合，导致模板的磷酸二酯主干在活性位点之后立即发生近90°的旋转。这种弯曲只用于暴露催化位点引物之后的第一个模板基。这种模板构象避免了任何关于哪个模板碱基准备好与下一个要添加的核苷酸配对的混淆(图8-8)。

与手指和手掌相比，拇指区域与催化作用并不密切相关。相反，拇指与最近合成的DNA相互作用(见图8-9)。这有两个目的。首先，它保持引物和活性位点的正确位置。其次，拇指有助于保持DNA聚合酶与其底物之间的紧密联系。这种关联有助于DNA聚合酶每次结合引物:模板连接时添加许多dntp(见下文)。

总而言之，每当DNA聚合酶在不断增长的DNA链上添加一个核苷酸时，就会发生一系列有序的事件。进入的核苷酸碱基对与下一个可用的模板碱基。这种相互作用导致聚合酶的“手指”在碱基配对的dNTP周围闭合。酶的这种构象将关键的催化金属离子置于催化形成下一个磷酸二酯键的位置。碱基对核苷酸与引物的连接导致手指的重新打开和引物的移动(模板连接处有一对碱基对)。然后聚合酶就可以进行下一轮的添加了。重要的是，这些事件中的每一个都是通过传入dNTP和模板之间正确的碱基配对得到强烈刺激的。

DNA聚合酶是过程酶

催化的DNA聚合酶是迅速。DNA聚合酶能够每秒增加多达1000个核苷酸到引物链上。

旋转

DNA聚合酶

(打开)参数

5 '底漆

模板

O-helix(关闭)

旋转

的O-helix

O-helix(关闭)

图8-7 DMA聚合酶“抓住”模板和进入的核苷酸当一个正确的碱基对，(a)变化的说明mDNA聚合酶结构在进入的裸核苷酸碱基对正确地与模板DNA配对之后。主要的变化是ftnger域称为O-hetix的一个螺旋的40”旋转。在开放构象中，这个螺旋远离进入的裸体，当聚合酶在给药构象中，这个螺旋移动，并与进入的dNTP发生几次重要的相互作用。酪氨酸与dNTP的外壳和两个带电残基与三磷酸盐相结合，这些相互作用的组合使dNTP成为由两个与DNA聚合酶结合的金属离子介导的催化。(b) T7 DNA聚合酶结合底物的结构，以剂量构象o型螺旋显示为紫色，为了清晰，蛋白质结构的其余部分显示为透明。关键的酪氨酸、赖氨酸和精氨酸可以在O-heiix的后面以粉色显示。进入dNTP的碱基和脱氧核糖用红色表示，引物用浅灰色表示，模板链用深灰色表示。两个催化金属离子用绿色表示，磷酸盐用紫色表示。(道伯利·S，塔博尔·S，朗·A·M，理查森·c·c，埃伦伯格·T. 5998。自然39}:251)。用BobScript, MolScript和Raster 3D制作的图像

DNA合成的速度很大程度上是由于DNA聚合酶的渐进性质。连续性是酶在聚合底物上作用的一个特性。在DNA聚合酶的情况下，连续性的程度被定义为每次酶结合pnnier时添加的核苷酸的平均数量。fempJate结。每个DNA聚合酶都有一个特征的连续性，从只有几个核苷酸到每次结合事件增加的超过5万个碱基(图8-9)。

通过在每个结合事件中添加多个核苷酸，DNA合成的速度显著提高。它是最初的绑定

图8-8模板DNA通过DNA聚合酶的路径示意图。最近复制的DMA与DNA聚合酶的手掌区有关。在活性位点上，模板单链区域的第一个碱基位于预期的双链DNA位置。随着模板链向5'末端的移动，磷酸化主链突然弯曲90°，这导致第二个和所有后续单链碱基被放置在一个防止碱基与活性位点上的dNTP结合的任何可能性的位置。

聚合酶经过引物模板连接，这是限速步骤。在一个典型的DNA聚合酶反应中，DNA聚合酶大约需要一秒钟的时间来定位和结合一个底漆;模板结．一旦结合，核苷酸的添加非常快，在毫秒范围内)。因此，一个完全非加工的DNA聚合酶大约每秒增加1个碱基对。相比之下，最快的DNA聚合酶通过与模板保持关联，进行多轮dNTP添加，每秒增加多达1000个核苷酸。因此，一个高度渐进的聚合酶通过增加DNA合成的总体速率

图8-9 DNA聚合酶以渐进的方式合成DNA。

这张图显示了过程性和非过程性DMA聚合酶之间的区别，最后一个DNA聚合酶结合引物:模板连接。结合后，非过程性酶在引物的3*端添加一个dNTP，然后从新的引物模板连接处释放。相反，过程DNA聚合酶每次与模板结合时都会添加许多dntp

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