漏斗体外筛选药物的给药
药物给药通常限于配方和体内给药的考虑。在模板/引线选择和优化过程中给药的定义应该考虑包括筛选漏斗中的许多情况(图2)。“药物传递”可与1°活性测定相关，通常作为高温ts平台的一部分运行，其中“传递”与化合物与相应靶标相互作用的可及性有关。显然，化合物必须处于溶液中，且与预期目标“自由”相互作用，即相互作用的能力由化合物的|i决定。
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图2。引线选择漏斗的例子，以及在体外和体内“药物输送”漏斗中的作用。
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图2。引线选择漏斗的例子，以及在体外和体内“药物输送”漏斗中的作用。
优化筛选过程中遇到的一个更常见的问题可能与重复试验之间的高变异性和不同试验之间的效价数字不一致有关(图3)。不同的体外试验通常在不同的实验室开发。一般来说，分析的发展是基于某些过去的经验和避免过去遇到的常见问题的方法。这一点，再加上测定方法对选择的培养基有非常不同的标准，以维持配体、蛋白质或细胞，
问题:测试之间的不一致
“也注意到重复试验的高可变性”
1体外检测
2°体外试验
优先考虑药效、溶解度、稳定性
3°体外试验
1°体内试验
2°体内试验
图3。筛选漏斗中“药物输送”问题的潜在后果和对效价读数的影响。
可以在不同的测定方法和通过稀释暴露的介质类型之间产生非常不同的稀释序列(图4)。通常认为这与最终读数无关，但这些不同的稀释序列和介质操作可能导致复杂的结果，其中结构活性关系(SAR)变得难以解释。在极端情况下，SAR可以反映物理化学性质，如溶解度、沉淀倾向或蛋白质结合倾向，产生与SAR一样的结构性质关系(SPR)。
2.5毫米在DMSO
正常Saine 1:25
酪蛋白缓冲1:4
v 0.025毫米
10毫米在DMSO
杜尔贝科PBS 1:10 0
10毫米在DMSO
FCS在PBS 1:100
v 0.02毫米
FCS在PBS
0.01毫米
图4。先导优化筛选过程中用于体外测定的稀释序列示例。稀释超过100倍的液体处理设备是困难的，因此经常使用顺序稀释。
0 50 100 150
时间(分钟)
图5。例如，在三种不同的体外试验中，将DMSO第一次稀释到不同的培养基中，低溶性铅会导致沉淀(通过浊度监测)(稀释方案见图4)。
如图5所示，当2.5 mM或10 mM DMSO溶液稀释化合物时，化合物的沉淀(以浊度观察)可以非常迅速地发生。在某些情况下，由于沉淀的初级颗粒聚集成更大的团聚体，然后从溶液中沉淀下来，浑浊度随着时间的推移而降低。在3°试验的情况下，胎牛血清(FCS)的存在明显地延缓了沉淀的速度，甚至限制了沉淀的程度。在HTS平台中，等分和稀释的时间可以在转移到下一个井或稀释顺序的化合物的精确数量中发挥作用。视情况而定，在下一次稀释时，可能会有结果沉淀物的再溶解，这又是一个高度依赖时间的过程，只会增加变化的可能性。在某些情况下，对测定方法或稀释序列的简单修改可以提供改进;例如，用第二次稀释时使用的含有酪蛋白的缓冲液代替第一次稀释时的生理盐水，就有可能获得相同的最终条件，但酪蛋白的存在表明浑浊度降低了近7倍，并减少了随后聚集和沉淀的趋势。类似地，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中加入人血清白蛋白(HSA)几乎完全消除了许多化合物在第一次稀释后的沉淀证据。药物化学家的物理化学背景在与生物学家一起设计分析方法时是有利的，最终导致改进的分析方法在读数中具有更少的可变性和模糊性。
尽管这些不同蛋白质的存在在防止沉淀和增加表观溶解度方面非常有价值，但它们也可以隔离药物和降低“游离药物”浓度。在上面的例子中,儒伯和同事(1999)能够证明化合物的游离药物浓度的问题是非常不同的在每个媒体和依赖于蛋白质的数量和类型的媒体(图6)。这种蛋白质绑定可以完全掩盖了实际能力的分子(图7)。通过减少白蛋白的量,提高读数上活动,似乎是一个不活跃的化合物,0.5%的白蛋白水平,可以获得。很明显，优化的先导必须在白蛋白存在的情况下具有高效和活性，才能成为可行的候选药物，但在先导优化过程中，明确分配结构修改的能力对受体结合和蛋白质结合的改变是合理药物设计的关键。虽然这是不切实际的决定绑定常量在优化阶段，对于所有潜在的引子，将筛选试验发展成可以在多种浓度的白蛋白或其他潜在结合蛋白下运行的方式是非常有帮助的。
以细胞为基础的体外检测，以细胞内为靶点，也可能有额外的渗透性成分，可能会混淆这些检测的结果。根据分子和细胞治疗模型的类型，各种主动运输系统，包括外排泵系统也可以发挥作用。在先导优化阶段，了解结构调整对个体的影响变得尤为重要
总药物浓缩的。(嗯)
图6。蛋白质结合和游离药物在各种筛选试验中的作用，每种筛选试验都使用不同的培养基成分和蛋白质。通过独立实验确定合适的结合常数确定曲线。
总药物浓缩的。(嗯)
图6。蛋白质结合和游离药物在各种筛选试验中的作用，每种筛选试验都使用不同的培养基成分和蛋白质。通过独立实验确定合适的结合常数确定曲线。
图7。血清白蛋白的存在可以掩盖与目标的实际相互作用，并极大地影响在目标结合周围生成SAR的努力。使用几种蛋白质浓度来帮助解蜗壳数据的价值被证明了。
图7。血清白蛋白的存在可以掩盖与目标的实际相互作用，并极大地影响在目标结合周围生成SAR的努力。使用几种蛋白质浓度来帮助解蜗壳数据的价值被证明了。
分析或模型的组成部分，并能够识别什么时候SPR与SAR实际被探测。虽然数据的反褶积可能需要提前花费时间，但它可以避免产生错误的SAR。系统和逻辑的药物设计，以及由计算模型驱动的模拟合成，使得筛选试验的输出更有必要只代表预期的目标绑定，而不是会偏离计算模型价值的复杂因素。因此，虽然制药科学家的参与有助于寻找更多的可药物化合物是有价值的，但同样重要的是，他们也为漏斗提供了更大的清晰度，并帮助消除或选择数据输入到计算模型。
人们通常认为，溶解度差、蛋白质结合度高或渗透性差，都会导致药物接触不足，这些都倾向于消除最低限度可接受的化合物。很难弄清楚的是，由于追逐SAR而失去的机会对复杂目标的影响，或者误报和误报的概率。通常认为这些理化限制会导致假阴性，但根据我们的经验，较差的理化特性也会导致筛选试验的假阳性。假阴性或假阳性的发生在很大程度上取决于检测方法，以及检测方法中聚合体和微粒或化合物和试剂共沉淀的可能性对读出或报告系统的影响。经常被忽视的是，化合物具有固有的表面活性或清净性，从而导致自胶束化(导致添加的浓度和|断开连接)，这可能导致试剂在胶束中隔离或细胞基础测定中的非特异性膜扰动(McGovern等人，2002年)。虽然在筛选时无法避免这些类型的干扰，但需要认识到它们造成的潜在歧义，以便处理。
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