打珠效率和偏置
珠打法一直是细胞裂解法的常用组成部分。土壤浆液(或提取细胞的悬浮液)与小球体(最常见的是0.1或0.2毫米的球体，有时与较大的小球混合)混合，并在高频摇动。珠打利用玻璃球之间的碰撞来打破细胞;因此，变形可能是细胞破裂的主要原因，尽管粘性剪切可能在高速下很重要。
在打珠过程中公认的关键物理参数是土壤、水和玻璃珠之间的比例、打珠频率和处理时间的长度(Bürgmann等，2001年)。有效的裂解显然可以通过将处理时间延长几分钟，以剪切释放的DNA为代价(只要DNA被填充在细胞球囊内，DNA的粘性剪切可以忽略不计，但当DNA在球囊内自由悬浮时，则显著显著细胞破裂)．因此，珠子敲打时间的选择是在害虫和霍乱之间的选择:短的珠子敲打时间只会溶解脆弱的细胞，而更健壮的细胞可能通过长时间的敲打而溶解，其代价是从脆弱的细胞中剪切DNA。Bürgmann等(2001)对不同版本的PCR打珠法进行了彻底的比较。甚至对珠子的类型进行了比较:不同珠子的混合物(0.1毫米、1.4毫米和单个4毫米的珠子)比同等大小的珠子表现更好;但是剪羊毛加剧了。DNA数量在6 ms-1 (6,300 rpm)处理45 s时达到平台;更严厉的处理产生的额外效果很少。重复治疗也没有效果(低强度治疗除外)。
一些研究人员系统地研究了珠子敲打或研磨后细胞裂解和DNA剪切的动力学(Van Elsas et al. 1997;Frostegard等1999;Bürgmann et al. 2001)，而其他许多人似乎在决定珠打时间时使用剪切猜测，从协议之间的巨大差异判断，他们似乎做出了很大不同的猜测(表3.1)。然而，严格的比较是困难的，因为很少有作者正确地报告珠子跳动的强度。至少有两个重要的参数:频率和振幅，它们共同决定了粒子之间碰撞的频率和能量。一些作者只是报告“全速”，一些报告频率和一些速度(m s-1)，都不够。此外，运动的性质(相互旋转)可能对碰撞的能量有一定影响;这样的信息很少被报道，无论是设备的生产者还是科学论文的作者。
我们根据以下假设，粗略计算了细胞大小与细胞变形破裂的关系:
1.玻璃微珠在碰撞时的变形可以忽略不计。
2.因此，每次碰撞都会使液体体积内的细胞破裂，这可以通过直接的几何计算，作为珠子的函数
表3.1。用珠打法使细胞破裂以提取NA
参考
设备/制作人
时间珠子/尺寸(mm)
(分钟)液体/ soil11
解决方案的^
Smalla等，1993 Briglia等，1996 More等，1994 Kuske等，1998
Howeler等，2003年
布劳恩均质机
Biospec，巴特尔斯维尔，俄克拉荷马州BX-4
Biospec
4000 Upm 5-10: 1:2:2
“全速”5-10:2:1.5:0.5
3300转
Borneman等，1996 FastPrep FP120
5女士
Cullen and Hirsch 1998年microdis- mator II，振幅5布劳恩，德国5毫米
(等量)
(等量)
磷酸盐120mM(pH = 8)
溶菌酶5 mgml”1
蒸馏水
磷酸
Tris-HCl Na-EDTA NaCl SDS
Tris-HCl磷酸盐NaCl SDS
氯仿异戊醇FastDNA自旋试剂盒按照制造商说明磷酸盐120mM(pH = 8)
SDS 1%
0.32 ml ml“1 0.013 ml ml
a液体、珠粒和土壤干重之间的重量比。b在打珠前进行酶处理。
c细胞悬浮液，而不是土壤。液体体积包括添加的细胞悬浮液。d含有基质的FastDNA管，“设计用于溶解大多数细胞类型”(生物101，目录no. 5)。6530 - 401)。
直径和临界变形，Dc，这是表面之间的距离，在此以下电池将破裂。
3.计算出的“破裂体积”vr(细胞因变形而破裂的液体体积)必然是细胞大小和壁的物理特性的函数。
4.因此，破裂率(Rs =单个冲程破裂的细胞比例)是单个细胞位于“破裂体积”之一的概率的函数，而“破裂体积”又是液体总体积(Vtot)和珠子总数(Nb)的函数，以及每个冲程每个珠子成功碰撞的假设数量(Cb): Rs = vr*Nb*Cb/Vtot。
5.因此，我们计算了直径为100 ^m(这是最常用的)的珠子的破裂率，Vtot = 1 (ml / g珠子)，Cb = 4。对三种临界变形距离Dc: 0.3、0.5和1 ^m的单元进行了计算。结果如图3.2所示。
结果与Moré等人(1994)的观察结果相当一致:假设他们的跳动速度为3000转/分，图3.2中5分钟的跳动等于15,000冲程。它说明了选择时的困境
数量的中风
图3.2。在以每克0.1毫米的珠粒含有1克液体的珠粒打珠机中，作为临界变形(Dc， |m)的函数估计细胞破裂，即低于此表面的细胞会破裂的距离。该图显示了原始细胞数(每组= 1)保持完整(未破裂)的比例，与笔画的数量作对比。计算的破裂率(冲程-1)取决于珠粒的大小。对于较大的珠子，如Smalla等人(1993)所使用的0.17毫米，计算出的速率大约为本文计算的20%。换句话说，在4000转、10分钟的转速下，他们的处理结果将是40000 /5 = 8000笔画
图3.2。在以每克0.1毫米的珠粒含有1克液体的珠粒打珠机中，作为临界变形(Dc， |m)的函数估计细胞破裂，即低于此表面的细胞会破裂的距离。该图显示了原始细胞数(每组= 1)保持完整(未破裂)的比例，与笔画的数量作对比。计算的破裂率(冲程-1)取决于珠粒的大小。对于较大的珠子，如Smalla等人(1993)所使用的0.17毫米，计算出的速率大约为本文计算的20%。换句话说，在4000转/分钟持续10分钟的情况下，他们的处理结果在当前图中珠打强度(时间或速度)下为40000 /5 = 8000冲程。在高速下，大/脆细胞的几乎完全破裂可能在半分钟内完成(如Borneman et al. 1996)。
珠打法也被用来裂解土壤样品中的真菌。例如，在向土壤中添加烟曲霉后，按照Cullen和Hirsch(1998)的方案进行珠打后，DNA回收率比在液氮中研磨后(Kabir等人，2003)更高，而在另一项调查中，液氮研磨也有类似的回收率，因此优于基于珠打的耗时更长的方法(Van Elsas等人，2000)。尽管不同的裂解处理对本土土壤真菌的效率还没有得到很好的研究，但通过珠打和直接DNA提取，获得了来自主要真菌门(子囊菌门、担子菌门、合菌门和壶菌门)的含有18S rDNA序列的克隆(Anderson et al. 2003;Gomes et al. 2003)。
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