土壤聚合物和C1化合物的生物降解

土壤中最普遍的天然聚合物是纤维素和几丁质。纤维素分解活性对碳循环至关重要,甲壳素作为土壤中最丰富的氮源发挥着独特的作用。甲壳素降解能力在土壤微生物(以及许多高等生物)中普遍存在,甲壳素是大多数环境中氮的重要来源。许多细菌具有多个几丁质酶基因,真菌几丁质酶在营养和菌丝细胞壁生长中可能具有双重作用。为了丰富这种多样而复杂的土壤微生物功能群,诱饵被用来促进功能基因的检索。不溶性基质(如甲壳素)可采用这种方法,垃圾袋已用于在现场条件下掩埋和随后回收基质。通过提取TC-DNA和RNA对底物进行分析,可以提供主要殖民者的功能和结构数据。设计简并引物以研究chi基因多样性(Williamson等人,2000年)。使用针对家族18亚组A细菌几丁质酶的特异性引物,比较接受不同处理的草地几丁质酶降解种群的多样性(Metcalfe et al.2002)。在接受污泥(S)和污泥加石灰(L)处理的地块中,从埋在草地上的几丁质诱饵中提取的TC-DNA中恢复的克隆文库以类节杆菌chi序列为主,而对照(C)和L地块中的文库包含类链霉菌和类麦芽寡养单胞菌几丁质酶序列。从诱饵中未发现关节杆菌分离株,但它们在来自TC-DNA的16S rRNA文库中有表达。恢复的克隆多样性在C和L库中最高(分别检测到7种和9种RFLP类型),而在S和SL库中最低(分别检测到3种和4种RFLP类型)。在S和SL文库中检测到最高的几丁质降解活性,表明污泥处理不会影响降解几丁质降解土壤活性但对土壤溶壳菌种群多样性有负面影响。在恢复与chi序列相关的系统发育标记之前,不可能确定优势功能群的身份;宏基因组学有望实现这一目标。

用稳定同位素标记的DNA可以分析功能和分类标记基因。Radajewski等人(2000年)开创了这种研究土壤中甲基营养素的方法。与在未标记甲醇上生长的对照相比,在13CH3OH上生长的甲基杆菌产生的DNA浮力密度增加。将标记的底物作为诱饵饲喂森林土壤微环境中的微生物群落,并用通用16S rRNA引物和mxaF引物(编码甲醇脱氢酶活性位点亚基)梯度离心和PCR后,从标记的DNA中制备序列文库。在标记的DNA片段中检测到两组,一组属于a-变形菌,另一组类似于酸杆菌科的成员,前者是预期的,但后者的培养成员中没有使用甲醇的报道。DNA/RNA稳定同位素探测(SIP)方法可以从16S rDNA分析中获得活性数据,因为要标记细菌,必须积极利用底物。如Morris等人(2002)所述,对包括mxaF、mmoX和pmoA(可溶性和颗粒甲烷单氧合酶的活性位点亚基)在内的功能基因的分析,除了证实16S rRNA分析得出的群落数据外,还可以提供更多关于群落结构和多样性的数据。SIP是一种非常强大的技术,但对于现场研究来说并非没有限制,主要是由于以下限制。首先,标记底物的价格很高,为了实现合理的标记,从而能够使用梯度离心分离重/标记和轻/未标记的DNA/RNA,需要在高消耗标记底物的情况下长时间培养。这种长时间的培养代表了SIP方法的另一个局限性,因为不同土壤微生物群之间的交叉饲养允许检测菌根真菌中植物代谢CO2中的标记碳。在这些条件下,可能会发生显著富集。我们的观点得到了以下事实的证实:大多数已发表的SIP实验要么使用微观世界/反应器研究,要么使用具有特殊营养需求/能力的微生物群(甲基营养菌、苯酚降解菌等),要么经常同时使用二者(Radajewski et al.2000;Manefield et al.2002;Lueders et al.2004a,b,c;Ginige et al.2004)。另一种方法是使用其他生物指示剂分子,如磷脂脂肪酸(PLFA)。气相色谱/质谱(GC/MS)分析从土壤微生物中提取的PLFA的高灵敏度,检测到16:1®5 PLFA的13C含量显著富集,表明丛枝菌根真菌的选择性富集(Johnson et al.2005)。

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