土壤酶的提取

1954年,在土壤提取物中测定了组织蛋白酶样活性(Antoniani等人,1954年)。然而,根据Skujins(1967),费米和萨布拉玛·尼安是第一个测量酶活性(分别为蛋白酶和氨化酶活性)。脲酶是在pH值为6的磷酸盐缓冲液中从表层森林土壤中分离出来的,并由Briggs和Segal(1963年)在美国纯化。在澳大利亚,Ladd(1972)使用pH值为8.1的0.1 M三硼酸缓冲液作为萃取剂,测定了几种牧草和小麦土壤提取物中的蛋白酶和肽酶活性。然后,在20世纪70年代和80年代,对土壤提取物中的裂解酶、氧化还原酶和水解酶活性进行了监测(Nannipieri等人,1996年)。已经提出了几种从土壤中提取酶的程序,它们通常基于使用盐溶液作为萃取剂。如Shcherbakova等人(1981)、Tabatabai和Fu(1992)以及Nannipieri等人(1996)所述,磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、三硼酸酯、硼酸酯等已用于从土壤中提取酶。人们认识到,净化从土壤中提取的酶是不可接受的,因为提取的酶可能是来自不同来源的酶的混合物(Nannipieri等人,1996年)。事实上,酶可以来源于土壤中各种微生物物种以及植物和真菌(Torsvik等人,1996年;Nannipieri等人,2003年)。有人建议土壤酶提取应提供高产量的提取酶,以便描述提取酶复合物的特性(Nannipieri等人,1974年, 1980, 1996). 此外,土壤中固定酶的有效提取程序应避免微生物细胞的分解(从而导致胞内酶的释放)、土壤提取过程中人工制品的形成,如提取的酶在可溶性复合物中的吸附或截留,以及萃取剂和无机成分之间的相互作用,以产生类酶活性(Nannipieri等人,1996年)。例如,柠檬酸盐可以与锰相互作用,形成复合物,显示出土壤萃取的漆酶样活性(Leonowicz和Bollag 1987)。Nannipieri等人(1974年)考虑到该溶液曾用于在温和条件下提取有机物,因此在中性条件下使用焦磷酸钠从腐殖灰化土中提取脲酶,而不会破坏微生物细胞(Bremner和Lee,1949年)。焦磷酸钠还可用于从粗纹理的土壤、红巧克力粘土壤土、灰棕色灰土、红黄色灰土和高山腐殖质土壤中提取脲酶(劳埃德1975)。使用相同的萃取剂从暗带恶劣的Rochrept土壤中提取fi葡萄糖苷酶和过氧化氢酶(Perez Mateos et al.1988;Busto和Perez Mateos 1995),并从松软土、组织土和淋溶土中提取磷酸酶、酪蛋白和苯甲酰精氨酰胺水解蛋白酶(Nannipieri et al.1980)。

氢氧化钠是在碱性pH值(12-13)下从土壤中提取有机质的常用溶液,用于从粘壤土中提取马拉硫磷酯酶;然后通过添加盐(MnCl2)和(NH4)2SO4沉淀的程序纯化酶,透析和离子色谱法。结果表明,提取的酶是一种糖蛋白(Getzin和Rosefield 1971;Satyanarayana和Getzin 1973)。然而,在研究酶-土壤-胶体复合物时,应避免碱性条件,因为酶会变性,微生物细胞会发生溶解。

比利时Mayaudon集团和意大利Nannipieri和Ceccanti集团主要对土壤中提取的酶进行了广泛的表征,目的是研究有机酶复合物的性质和状态及其形成过程(Nannipieri et al.1996)。这两个小组使用不同的提取程序,因此可能研究不同的酶复合物。

漆酶、多酚氧化酶、磷酸酶、磷酸二酯酶、芳基硫酸盐酶、纤维素酶、木聚糖酶、3-葡萄糖苷酶、转化酶和蛋白酶,通过用磷酸盐摇动牧场土壤提取-EDTApH值为7-8,持续1h(Mayaudon等人1973年;Batistic等人1980年),被认为是真菌糖酶,通过包埋在革兰氏阴性细菌合成的脂多糖中而防止蛋白水解(Mayaudon 1986年)。还假设这些多酶脂多糖复合物通过钙桥与腐殖质基质相连,并且由于EDTA螯合了这些钙离子,因此它们被磷酸盐萃取(图4.2)。根据Mayaudon(1986),真菌酶和细菌脂多糖之间的相互作用发生在后者一旦释放到土壤环境中部分水解后。

焦磷酸盐提取的酶制剂富含腐殖质;只有在pH值为7.1的焦磷酸钠彻底超滤土壤提取物后,才通过凝胶色谱法对这些腐殖酸酶复合物进行分级(Ceccanti等人,1978年)。丢弃分子量低于10000的化合物,并通过超滤将保留的物质分离为分子量高于(AI)和低于(AII)100000的两个部分。这两种组分(Ai和Aii)的凝胶色谱分别得到了三种和两种分子量不同的脲酶活性组分(Ceccanti等人,1978年)。以焦磷酸钠为洗脱液的最高分子量组分(AI)的凝胶色谱显示出三个磷酸酶活性峰和一个蛋白酶(酪蛋白和苯甲酰精氨酸水解蛋白酶)活性峰,而最低分子量组分(AI)的凝胶色谱显示出三个磷酸酶活性峰和一个蛋白酶活性峰

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图4.2。稳定酶在微生物生态学中的可能作用(上面是Burns的模型;下面是Mayaudon的模型)(1982年由Burns修改)。P产品;S基板;Em诱导的微生物酶;E酶

使用水作为洗脱液的组分(AII)给出了每种酶活性的一个峰值(Nannipieri等人,1985年)。

通过热解气相色谱(Py-GC)对土壤提取物进行表征表明,pH值为7.1的0.1 M焦磷酸钠提取了完整或部分分解的浓缩腐殖物质、糖蛋白碳水化合物(Bonmati等人,1988年)。土壤提取物对三种不同的蛋白酶底物有活性:N-苯甲酰-l-精氨酸酰胺,对胰蛋白酶有特异性,N-苄氧羰基-l-苯丙氨酸-l-亮氨酸(ZPL),对羧肽酶有特异性,酪蛋白基本上没有特异性。

通过元素分析、Py-GC和等电聚焦(IEF)对AI和AII组分的表征表明,这两种组分的C/N比都高于纯组分蛋白质与同一土壤中的腐殖酸和黄腐酸性质相似(Ceccanti et al.1986)。此外,与Aii组分相比,AI组分富含碳水化合物和高凝腐殖质。超滤或凝胶色谱后,这些水解酶的总活性通常会增加,这可能是抑制性腐殖酸成分和酶分离的结果(Nannipieri等人,1985年)。分子量较高的磷酸酶和脲酶活性组分比分子量较低的酶活性组分更耐热变性和蛋白水解(Nannipieri等人,1978、1982、1988)。假设这些数据验证了Burns等人(1972a)的假设,他们提出水解酶(脲酶)被截留在有机或有机矿物复合物中,并被腐殖网络包围,孔隙足够大,允许底物和水解反应产物通过,但并非高分子量化合物如蛋白酶的通过(图4.2;Nannipieri等人,1996)。

通常,关于土壤中酶提取和酶复合物表征的研究主要集中在水解酶(脲酶、磷酸酶、3-葡萄糖苷酶等)上,因为它们在养分循环中的重要作用,以及关于各模型复合物(如粘土)性质的大量文献(见第7章)。必须强调,该领域目前的知识首先来源于1970年代和1980年代进行的研究。此外,已经证实,在从土壤中提取酶复合物的过程中,可能会出现人工制品。

继续阅读此处:土壤蛋白质组学

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  • 恩里科·罗马诺
    如何从土壤中分离酶?
    4年前