土壤酶活性的测定

土壤酶活性经常被提出作为土壤质量的敏感指标。正如Schloter等人(2003)所强调的那样,“阻止矿用土壤质量的理想土壤微生物和生化指标测量起来很简单,应该在所有环境中同样有效,并可靠地揭示出哪里存在哪些问题”。这组作者认为酶法测定方法非常有用,因为它们是短期的实验室程序,通常在标准化的环境条件下进行(使用筛过的样品,最佳温度和pH值,以及标准化的含水量),这可以防止或尽量减少土壤生物群组成的变化,并允许比较从不同实验室获得的不同土壤的数据。

然而,需要精确可靠的方法来理解考虑的参数和观察到的参数之间的因果关系土壤酶活性修改。在测量土壤的酶活性时,会出现两种不同类型的问题。第一个问题与要测量的酶的选择有关,而且主要取决于正在进行的研究的目标。第二个问题与待测土壤酶的内在性质有关,涉及到适当方法的选择。然而,同样重要的是要记住,酶样反应发生在土壤中,可能有助于测定酶活性(Ruggiero et al. 1996)。

如果研究的目标是对不同土壤的微生物活性进行表征和/或得出土壤微生物功能多样性的指数,那么就应该测量大量酶的活性。事实上,一个单一的测量不太可能代表功能多样性的指标,它反映了多种生物化学途径(Nannipieri et al. 1990;Schloter et al. 2003)。此外,应注意主要代谢途径的酶活性,如在活细胞中活跃的脱氢酶或同化硝酸还原酶活性(Dick 1994)。

如果研究的目标集中于过程一级的调查,例如土壤对施用化肥、改改剂或杀虫剂的反应,评价土地使用的影响,或监测土壤污染和修复行动后的恢复情况,则可能适合测量特定底物转化过程中涉及的酶活性,而不特别注意其来源或地点。同样在这种情况下,单一酶活性的测定是不够的,原因如上所述。

酶的测定是基于对释放的产物或消耗的底物的定量评价,因此它们不能区分不同种类的酶对整体酶活性的贡献(Burns 1982年)。如上所述,同样的酶可以在活细胞内、死细胞或细胞碎片中或细胞外游离或被土壤胶体吸收。通过简化,我们可以说这种酶可以以三种形式存在于土壤中:在溶液中游离,在活细胞内,在有机矿物复合物上固定。很明显,这些酶形式可以以不同的方式发挥作用。例如,固定化形式可以非常稳定,并几乎完全保留其活性,而其他两种形式的活性可以被抑制剂抑制。

Nannipieri等人(2002)对区分不同种类土壤酶的不同方法方法进行了批判性和彻底的研究。对对土壤酶活性有贡献的胞内和胞外组分的鉴定和定量已得到特别注意。这无疑是解释土壤酶活性中最重要的问题之一。一种方法是在用C和N基质改良土壤的培养过程中测量微生物生长和酶活性。每种酶的活性与微生物生物量进行对比,在相同的孵育时间测定;如果存在线性相关,则将直线外推到微生物生物量为零的情况下,就得到了代表细胞外酶活性的纵坐标(酶活性)的截距。这种方法假设酶分析检测细胞内和细胞外的酶活性。第二种方法假设酶的测量只检测细胞外酶活性(Klose和Tabatabai 2002)。经过CHCl3熏蒸或超声波处理后,由于微生物细胞的裂解,可以测量细胞内和细胞外的酶活性。这种方法存在的缺点是,蛋白酶在CHCl3熏蒸过程中是活跃的,并部分水解酶(Renella et al. 2002),释放的酶可被土壤胶体吸附,随后发生变性(Fornasier 2002)。 These processes can obviously lead to an underestimation of the contribution of intracellular enzymes. Furthermore, the efficacy of CHCl3 fumigation on the lysis of microbial cells may change with changing soil structural properties, thus affecting the reliability of the method (Badalucco etal. 1997).

测量超声处理前后土壤的酶活性也被认为是区分土壤细胞内和细胞外酶活性的可靠方法(Badalucco, pers。通讯)。除了CHCl3熏蒸法的相同问题外,超声波处理土壤可以促进矿物颗粒和有机质的分解和分馏,从而有利于与土壤胶体相关的酶的释放,这些酶的活性在超声波处理之前无法确定。事实上,酸性磷酸酶活性的持续增加(比未处理的样品高出156%)被假设是由于超声波释放了大量酸性磷酸酶活性,当与土壤胶体相结合时未被检测到(De Cesare et al. 2000)。但也不能排除超声裂解细胞后胞内酸性磷酸酶的释放。

在孵育期间,还在酶测定中加入了不同的化学试剂,以抑制微生物的生长以及由于新的合成而导致的酶活性的增加蛋白质.甲苯是酶分析中使用最多的防腐剂之一,特别是在水解酶分析中,但它存在一些缺点,如对被测酶的活性有直接抑制或刺激作用(Acosta-Martinez和Tabatabai 2002)或增加微生物细胞的渗透性,从而过高估计细胞内酶活性(Skujins 1978;Nannipieri et al. 2002)。然而,Klose和Tabatabai (1999a,b)证明,在甲苯处理后,细胞内芳基磺酸酶或脲酶的活性都没有被完全检测到,而且这些酶没有被甲苯抑制。

确定所谓稳定的细胞外酶活性的合理方法可能包括在测定之前对土壤进行有效的消毒。有许多方法可用于土壤消毒(Trevors 1996)。然而,该方法存在以下缺陷:该方法不能有效地消除土壤微生物种群;土壤的化学和物理性质可能会发生改变,从而导致固定化酶的相对组分发生变化;细胞内酶可以在灭菌后释放。因此,对所调查土壤的胞外酶活性的估计有可能过低或过高。

通过比较土壤中酶活性与合成酶模型系统的酶活性的性质和行为,可以间接评价不同酶类对土壤中酶活性的总体贡献。采用该方法研究了三种除草剂(阿特拉津、百草枯、草甘膦)和一种杀虫剂(西维因)对转化酶、脲酶和磷酸酶活性的影响,表现为:(1)游离纯化酶,模拟土壤溶液中游离酶的组分;(2)合成粘土-、有机-和有机-粘土-酶复合物,模拟酶-土壤胶体的结合;(3)土壤酶(Gianfreda et al. 1993, 1994, 1995, 2002;Sannino和Gianfreda 2001)。激活、抑制或无影响取决于农药和酶制剂,因此表明土壤中酶的“状态”很重要,不能一概下结论。当研究这四种农药对土壤酶活性的影响时,也得到了复杂的反应(Gianfreda et al. 1994,1995;Sannino和Gianfreda 2001)。在意大利不同地点采样的22个土壤中,发现了四种农药对转化酶、脲酶和磷酸酶活性的增加、降低和不影响(见12.7节)。此外,部分土壤酶活性对4种农药的响应与其中一种模型系统的响应相似,可能是因为该模型在相关土壤中普遍存在。 In addition, the clays of soil protected phosphatase activity against the inhibitory effect of carbaryl and atrazine. This was confirmed by the fact that phosphatase immobilised on montmorillonite was less affected by the pesticides than the free and organo- and organo-mineral-complexed phosphatase.

迄今报告的所有调查结果的结论是,不幸的是,迄今还没有能够准确和明确测量土壤酶组分的方法。

在酶的测量中,就像其他微生物和生物化学测量一样,土壤样品应该代表被研究土壤的自然状况(代表性采样),生物化学和微生物土壤特性的采样策略应该考虑它们的时间和空间动态(Dick et al. 1996a)。因此,必须明确采样时间、采样数量及其水平和垂直分布、采样程序和采样装置。在进行准确的抽样程序时,可以提出一些简单的规则。为了防止时间的异质性和可变性,采样应该在给定的时间段内重复进行,可能在相同的时间间隔内进行。可以使用复合或混合良好的样品,在这种情况下,只要采样区域具有均匀的性质,就可以获得被调查土壤性质的平均值(Dick等,1996b)。此外,如果目的是获得关于所研究酶在微位点水平上的变异性的任何信息,则应收集大量的样品并进行地质统计学分析,以充分确定所研究酶的空间变异性(Bonmati et al. 1991)。

如果土壤预处理和储存对测量土壤的物理和化学性质并不重要,那么它们在测定生物化学活性方面是至关重要的(Brohon et al. 1999)。如果不能在采样后立即进行测量(Alef和Nannipieri 1995;Gianfreda和Bollag 1996;Tabatabai和Dick 2002)。贮藏过程中酶活性的变化取决于土壤贮藏的时间和温度,以及被研究土壤的理化特性(Brohon et al. 1999)。有人建议在酶测定前对土壤进行风干处理(Burns 1978a;Alef和Nannipieri 1995;Gianfreda和Bollag 1996;Tabatabai和Dick 2002),但新鲜样品的测量更可靠(Rao et al. 2003)。酶活性对土壤风干和潮湿土壤储存的响应可能是酶特异性的(Luo et al. 1996)。 Probably, the activities of enzymes stabilised by soil colloids are less affected than those associated to living cells by air-drying (Ladd 1985; Gianfreda and Bollag 1996). The response of enzyme activity of air-dried soils can be different in respect to that of the same enzyme activity of moist soil, thus indicating that they are different. The inhibition of several trace elements on aspartase activity (Senwo and Tabatabai 1999) was greater in air-dried than in field-moist soils whereas opposite behaviours have been observed for cellulase (Deng and Tabatabai 1995) and arylamidase activities (Acosta-Martinez and Tabatabai 2001).

如前所述,试验条件如缓冲液是否存在、pH值、底物及其浓度、温度、土壤摇动、微生物增殖抑制剂等,显著影响所测活性(Burns 1978a;Alef和Nannipieri 1995)。通常,土壤酶的测定是基于使用合成的、人工底物的缓冲溶液,其浓度足够高(饱和浓度),可以在整个酶的时间过程中假设恒定,并假设零级动力学。此外,底物浓度应远远高于酶的浓度,使反应速率与酶浓度成正比。

Miller等人(2001)建议使用低浓度的基质,以模拟环境条件。他们测定了大麦土壤中两种类型的酰胺水解酶活性:低亲和酶活性(Km值为30-60 mM)和高亲和酶活性(Km值为0.5-1.0 mM),后者代表活性微生物的酶活性。采用了类似的方法来测定高亲和力和低亲和力l-谷氨酰胺合成酶(Sallis and Burns 1989)和l-组氨酸解氨酶(Burton and McGill 1989, 1991)的活性。可能,在自然条件下,微生物应该使用低底物浓度的高亲和系统(Unanue et al. 1999)。

使用不同的基质可能有助于更好地理解酶活性在土壤养分转化中的作用。例如,Tabatabai等人(2002)研究了爱荷华州几种土壤的酰基芳酰胺酶(一种参与n矿化极限步骤之一的酶)对8种底物的活性,这些底物的氨基酸组成不同。动力学(Km和Vmax)和热力学(AHa和Ea)参数取决于土壤和氨基酸部分,因此表明土壤中存在酶异构体(Tabatabai et al. 2002)。

当基质的消失和/或反应产物的形成可能改变土浆的pH值时,通常选择缓冲与非缓冲条件,因为在测定过程中需要一个最佳的pH值。酸性和碱性土壤的磷酸酶活性分别在酸性和碱性土壤中占主导地位(Eivazi和Tabatabai 1977),因此Dick等(2000)提出酸性(AcdP)和碱性磷酸酶(AlkP)活性也应作为pH的指标。

一种土壤酶活性的测定方法是可靠和适用的,它应该在不同性质的土壤上进行试验和验证。事实上,主要问题可能来自于基质和/或产品对土壤颗粒的吸附,以及土壤中存在的元素或化合物可能产生的干扰。例如,对硝基苯衍生物是几种土壤酶(酸性和碱性磷酸酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶和芳基磺酸酶)活性测定的常用底物,它们被水解为可能被土壤胶体吸附的对硝基苯酚(pNP)。为避免对对硝基苯酚吸附活性的错误评价,对硝基苯酚的吸附应进行定量评价。因此,在被研究土壤存在的情况下(测定中使用的量)和在酶测定的实验条件(温度、培养时间、试剂添加)下,应使用不同数量的对硝基酚来制备校准曲线。当在具有不同的氨氮固结能力的土壤中测定脲酶活性时,可能会出现类似的问题。NH+固结土和非固结土脲酶活性受缓冲剂(Tris-、硼酸盐或非缓冲剂;奥图尔1991)。由于在饱和底物条件下底物浓度变化很小,因此通常监测产品外观而不是底物消耗,以达到更高的分析灵敏度。

研究土壤中的某些化合物或元素可能与反应产物发生反应,从而影响所测活度。例如,铜与三苯甲马赞发生非生物反应,三苯甲马赞是用四唑盐(TTC)作为电子受体测定脱氢酶活性的最终产物(Chander and Brookes 1991)。不幸的是,Cu还与2-对碘苯-3-对硝基苯-5-苯基四唑甲醛(INTF)反应,后者是2-对碘苯-3-对硝基苯-5-苯基四唑氯化铵(INT)的最终产物,后者是用来测量土壤脱氢酶活性的替代底物(Obbard 2001)。百草枯影响碱性环境中400/405 nm对硝基苯酚的测定(Gianfreda等,1993年)。用缓冲液从土壤中提取的有色化合物会影响基质或反应产物的比色测定。

使用底物衍生物,酶法生产荧光最终产物,被认为是提高酶法测定灵敏度和避免上述一些问题的有效替代方法(Marx等人,2001年)。这些测定基于使用荧光团标记的人造底物,这些底物来自水溶性荧光团(例如羟基取代和氨基取代香豆素、荧光素和罗丹明),经酶转化为具有不同于母体化合物光学特性的高荧光水溶性产物。酶的测定是快速的,可以用微板方法测量土壤的几种酶的活性,它允许测量几个土壤样品(Wirth 1992;沃斯和沃尔夫1992年;Sinsabaugh等人2000年;马克思等2001年;Vepsalainen et al. 2001;除梗器2004;Wittmann等人。2004)。表12.2总结了微板荧光法和对硝基苯酚法的优缺点。

尽管多底物方法提供的结果与经典酶分析的结果密切相关,但它存在一些缺陷,可能会限制其在不同土壤中的应用(Stemmer 2004)。事实上,基质的恢复是不完全的,因为它吸附在土壤基质上,不同物理和化学性质的土壤表现不同,由于化学性质相似的基质发生了竞争抑制,来自不同pH值的土壤的数据无法比较,因为多基质试验是在土壤pH值下进行的(Stemmer 2004)。

正如广泛讨论的那样,由于测定中采用的实验条件,目前的酶测定给出了潜在的而不是真实的酶活性(Burns 1978a, 1982;Nannipieri等。1990,2002;Gianfreda和Bollag 1996)。出于这个原因,Schloter等人(2003)提出,目前的土壤酶测定给出的是“土壤基因型中编码的”酶活性的度量,而不是“表型活性”。这显然限制了酶活性数据的有用性,并限制了它们的解释。

另一个问题是缺乏标准化,因为使用了不同的协议来确定土壤中的酶活性,如Burns (1978b)在测定脲酶活性时指出的那样。不幸的是,这种变异仍在继续,如表12.3所示,该表报告了过去5年用于测定土壤脲酶的实验条件。值得注意的是,相同的研究小组在不同的研究中采用了不同的条件,并没有对这种变化提供合理的解释。

另一个问题是酶样反应的存在,这种酶样反应不能用目前的测定方法来区分(Huang 1995;Ruggiero et al. 1996;Nannipieri et al. 2002)。粘土、金属氧化物和氢氧化物可以催化大量的反应;例如,有机

表12.2。4-甲基伞形花序酮(MUB)微板荧光法与对硝基苯酚法测定土壤酶活性的比较(马列等,2001年)

4-Methylumbelliferone产品

测量fluorimetrically

激发在365 nm,发射在460 nm

MUB荧光与ph有关

对低浓度尤其敏感

无已知副作用

土壤颗粒和酚类化合物对荧光的猝灭作用

MUB分子具有很强的流动性

的测定

所需底物数量少(|l)孵育时间短(35分钟)底物难以溶解随着时间的推移产品释放的连续监测(1读取周期min-1)直接在反应介质中进行测量

同时处理大量的样品和重复(96孔板-1)

板的设置和测量在不到1h

一次性材料(微板,万能瓶,移液管头

自动计算活性率(荧光相对单位min-1

在405 nm处的吸光度对硝基苯酚的吸光度是ph依赖性的对硝基苯酚的低灵敏度干扰有机物质对硝基苯酚被吸附

土壤的重量添加大量的底物(毫升)中等到长孵育时间(1-24小时)底物瞬间溶解孵育结束时的一次读数

需要停止反应并在测量前提取产物(测量不能延迟,否则会形成Na2CO3)每次运行最多50次测试

实验准备,孵育,产物提取和测量>3.5 h

使用耗时制备的玻璃设备

背景吸光度的提取

昂贵的分析设备,低成本分析

[荧光平板阅读器,多通道(数字)移液器,微平板]

大量可利用的基质可利用的基质可利用的化合物,通常是酚类化合物,在其氧化产物中被转化,这些非生物反应参与腐殖质的形成(Ruggiero et al. 1996)。

表12.3。土壤脲酶测定的实验条件

参数

克洛泽和

Sinsabaugh

杰出人物和Nannip -

泰勒等人(2002)

Caravaca和

Renella

Tabatabai (1999)

et al . (2000)

ieri (2001)

Roldan称(2003)

et al . (2004)

尿素浓度

0.20米

0.02米

0.08米

8.9毫米

1米

未指定

pH值

9.0

5.0

未指定

10

7.0

未指定

缓冲

0.1 mtham

50mm醋酸盐(或去离子水)

未指定

75毫米硼酸盐缓冲液

0.1米磷酸

0.1米磷酸

孵化温度

37摄氏度

20摄氏度

37摄氏度

20摄氏度

30度

37摄氏度

培养时间

2 h

18 h

2 h

4 h

1.5 h

土壤/水溶液

未指定

1:100

2:1

5:22.5

0.5:0.5

0.5 3:2

比(w / v)

NH +

未指定

水杨酸-

水杨酸-

水杨酸-

流动注射

测量

氰尿酸盐

氰尿酸盐

氰尿酸盐

分析器耦合

试剂盒

试剂盒

试剂盒

用分光光度计

土壤状况、治疗

Field-moist土壤

土均质,

新鲜的土壤

Field-moist土壤

Field-moist土壤

土壤湿润

或预处理

在pH为5的醋酸盐缓冲液中进行氧化

储存在4c

储存在4c

至50% WHC, 25℃预孵育7天

继续阅读:酶活性与土壤物理性质和土壤深度的关系

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  • 尼尔斯
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  • 草木犀属植物
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  • Juliane Faerber
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    如何测定土壤中的酶?
    3年前
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    如何测定土壤酶活性?
    3年前
  • Kirsti
    如何测量土壤酶?
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  • 霍布森
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    如何测量土壤酶活性?
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  • annikki
    什么是土壤酶测定?
    6年前
  • Segan
    如何测定土壤中脱氢酶的活性?
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