Pcr组件

3.1.PCR的核酸模板聚合酶链式反应从DNA模板(基因组DNA或RNA衍生的cDNA)中扩增特定的序列，这些DNA可以从不同的样本来源中制备(图2)。该DNA可以是直接从实验或患者材料中分离的基因组DNA，也可以是通过聚合酶或逆转录酶从DNA或RNA模板中合成的cDNA。各种来源的生物材料可用于制备PCR模板。在实验室中，PCR模板可以从培养的细胞或组织切片中获得。临床标本可从各种体液(如血液和羊水)，以及外科样本(如冷冻肿瘤)中提取(7)。法医标本可从头发样本、血液或精液中提取(8)。除了新鲜标本外，从固定组织(石蜡包埋标本)中提取的DNA可常规(很少例外)用于PCR应用(9)。PCR分析已被应用于从生物材料化石中提取的史前DNA(10)。

大多数PCR反应扩增DNA序列中的小目标(200-1000 bp)。因此，不需要高分子量的DNA，高碎片化的DNA(如从石蜡组织切片中获得的DNA)可以被有效利用。然而，某些组织固定剂(如含有苦味酸的布因溶液)和治疗方法(如组织脱钙)会损害DNA，使组织无法进行分子分析。当决定DNA模板的来源时，尤其是在研究中考虑使用存档标本时，应该牢记这些简单的指南。RNA的制备通常需要新鲜或冷冻的组织，尽管目前正在开发的技术有望从石蜡组织切片中产生可分析的RNA。

3.2.DNA聚合酶酶在多聚酶链式反应DNA聚合酶是PCR引物延伸步骤中DNA合成所必需的。当代PCR采用TaqDNA聚合酶(iso迟自T. aquaticus)(11)。Taq聚合酶显示5'^3'聚合酶的活动， 5'^3' exonu清除活性，热稳定性，最佳性能在70-80°C(5,12)。温度、pH值和离子浓度(Mg2+)可以影响Taq聚合酶的活性。Taq活性在95°C下的半衰期约为40-60分钟(13,14)，极高的变性温度(>97°C)将显著降低其活性寿命。由于温度时间是维持Taq活性的关键参数，在PCR过程中降低变性温度或缩短变性时间可以延长酶的活性。PCR的最佳pH值在8.0到10.0之间，但必须通过经验来确定。典型的PCR将在pH为8.3的缓冲液(通常是Tris-Cl)中进行。Taq聚合酶需要Mg2+形式的二价阳离子。较低的二价阳离子(Mg2+)浓度通过稳定酶-核酸相互作用降低了酶从模板上分离的速率(15)。大多数

档案材料外科样本

(石蜡包埋)(冷冻组织)

我培养的j。

DNA ^逆转录cDNA

图2所示。PCR核酸模板的来源及衍生分析方法。PCR分析可以使用DNA或cDNA (RNA)进行，它们可以从各种来源制备，包括所示的和其他来源(如法医样本)。PCR形成了许多分析技术的基础，其中一些是基于目标序列的差异扩增。其他基于PCR的方法涉及到PCR产物分析的高级应用(例如用于突变检测的电泳方法)。

图2所示。PCR核酸模板的来源及衍生分析方法。PCR分析可以使用DNA或cDNA (RNA)进行，它们可以从各种来源制备，包括所示的和其他来源(如法医样本)。PCR形成了许多分析技术的基础，其中一些是基于目标序列的差异扩增。其他基于PCR的方法涉及到PCR产物分析的高级应用(例如用于突变检测的电泳方法)。

PCR混合物将包含至少1.5 mM的MgCl2。然而，对于任何新的模板-引物组合，建议采用MgCl2滴定法。

虽然Taq DNA聚合酶是常规PCR的理想选择，但还有其他几种具有独特品质的耐高温DNA聚合酶(16)，使它们在特殊的PCR应用中非常有用，如长片段DNA扩增或高保真扩增。Taq聚合酶的错误率约为1 × 10-4到2 × 10-5错误/bp(包括碱基取代和移码错误)(17,18)。排气聚合酶(也称为Tli聚合酶，来自海岸热球菌)的错误率为2 × 10-5到5 × 10-5错误/bp(19,20)。除了它比Taq聚合酶的保真度更高外，Vent聚合酶在95°C(19)下的半衰期约为400分钟，使它成为一种非常耐受性的酶。用于PCR应用的保真度最高的聚合酶是Pfu聚合酶(来自狂怒火球菌)，其误差率为1.5 x 10-6个错误/bp(21)。使用Vent和Pfu聚合酶(与Taq相比)观察到的保真度的提高与这些酶固有的3'^5'外切酶校对活性有关。Taq聚合酶缺乏3'^5'外切酶校对活性。对于高保真度的应用，如DNA的PCR扩增用于序列测定，使用高保真度的聚合酶是首选。一些制造商还生产用于专门PCR应用的DNA聚合酶混合物。其中一种被称为扩展高保真聚合酶混合物，它包含Taq(聚合酶活性)和Pwo(校对)。 This blend is used in long PCR applications that require a higher fidelity than Taq can provide when used alone.

3.3.寡核苷酸引物的设计寡核苷酸引物的设计可能是决定PCR成功与否的最关键因素。有效的PCR寡核苷酸引物特异性高，无二级结构，与目标序列形成稳定的双工链。在设计一组寡核苷酸引物时，基本上需要考虑四个参数:(1)被扩增的目标序列的大小，(2)目标序列在整个基因组DNA(或cDNA)序列中的位置，(3)目标区域和侧翼区域内的二级结构，(4)扩增的特异性。目标序列大小的选择应使PCR产物的长度范围在400 - 2000 bp之间。长度小于400 bp的产物很难用标准琼脂糖凝胶电泳技术进行解析，并且可能被过量引物或PCR伪影所掩盖。由于Taq聚合酶的连续性有限，大于2000 bp的产物扩增效率可能较低(22)。引物长度影响杂交靶的特异性和效率。长寡核苷酸引物可能对目标序列更特异性，但在杂交时效率较低，而短寡核苷酸引物在杂交时效率较高，但对目标序列特异性较低(23)。一般来说，寡核苷酸引物的长度应为17-30个核苷酸。 Whenever possible, both primers should be of the same length because oligonucleotide primer length influences the calculated optimal annealing temperature for a specific primer. The base composition of the oligonucleotide primers is also important, because annealing temperature is governed in part by the G + C content of the primers. Ideally, G + C content should be 50-60%, and the percent G + C should be the same or very similar for both oligonucleotide primers in any given primer pair. The 3'-terminus of an oligonucleotide primer should contain a G, C, GC, or CG. Given the tighter hydrogen-bonding between G: C pairs, the presence of these nucleotides at the 3' end of the oligonucleotide primer reduces the possibility for excessive breathing of the target-primer duplex, increasing the efficiency of primer extension. However, runs of C or G at the 3' end of an oligonucleotide primer should be avoided, as these can cause nonspecific hybridization with GC-rich sequences. Repetitive or palindromic sequences should be avoided in an oligonucleotide primer, and primer pairs should not contain sequences that are complementary to each other. Likewise, oligonucleotide primer pairs should not hybridize elsewhere in the gene being amplified or in other sequences contained within the genome. Web-based tools are available for easily analyzing the characteristics and properties of selected oligonucleotide primers (http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html)．

当设计用于逆转录酶(RT)-PCR的寡核苷酸引物时，所有的寡核苷酸引物设计的一般指南都适用，但需要一些额外的特殊考虑。目标序列在感兴趣的基因中的精确位置必须仔细选择。这与使用oligo(dT)作为引物的mRNA模板的反转录常常不能产生全长cDNA转录本有关。因此，距离mRNA 3'端较远的靶序列的扩增可能很难完成。在大多数情况下，选择距离mRNA 3'端1kb以内的目标序列将确保PCR扩增成功。然而，如果一个基因的5'区域的目标序列需要扩增，有专门的技术可以促进这种扩增。一种选择是在反转录步骤中使用基因特异性寡核苷酸引物，这将产生包含感兴趣的目标序列的cDNA模板。另一种从mRNA中获得5'端序列的方法称为5' RACE(用于cDNA末端的快速扩增)(24)。RACE技术可以应用于mRNA转录本的3'或5'端，当基因该区域的mRNA序列未知时尤其有用。mRNA二级结构是RT无法合成全长cDNA转录物的另一个原因，因此应尽可能避免已知具有庞大二级结构的区域。 RNA folding algorithms capable of predicting secondary structure within regions of known sequence are available (25).

引物的最佳退火温度(Tm)对于正确建立有效的PCR是非常重要的。用最近邻热力学计算方法可以最精确地计算寡核苷酸引物的熔化温度，其表达式为:Tm = H[S + R ln(c/4)] - 273℃+ 16.6 log10[K+]，其中H为焓，S为螺旋形成的熵，R为摩尔气体常数，c为引物的浓度。使用引物设计和分析软件，包括一些基于web的程序(如http://www.rnature.com/oligonucleotide.html或http://alces.med.umn.edu/rawtm.html)．然而，可以使用简化公式计算引物熔化温度的极好近似，该公式通常适用于长度为18-24 bp的寡核苷酸引物。计算任何引物退火温度的一个简单公式是Tm = 69.3 + 0.41(%G + C) - (650/L)，其中L是引物碱基长度(26)。这个计算的另一个公式是T = 2(A + T) + 4(G + C)，其中A + T和G + C是指每组的碱基数。引物退火温度最好在55°C到72°C之间，但许多标准PCR引物的退火温度为55-65°C。

已经开发了几种计算机算法和程序，以方便设计具有适当特性的引物用于PCR应用。许多基于web的寡核苷酸引物设计程序可供选择，包括oligperfectdesigner (http://www.invitrogen.com), Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)和DoPrimer (http://doprimer.interactiva.de/index.html)．基于网络的工具也可用于设计特定于感兴趣基因的外显子和内含子序列的引物(http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html)和制备简并寡核苷酸引物(http://bioinformatics.weizmann．ac.il /块/ codehop.html)。

3.4.典型的聚合酶链反应混合物包括反应缓冲液、寡核苷酸引物、Taq聚合酶和适当的DNA模板。PCR缓冲液由50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、10-50 mM Tris-Cl (pH 8.3)和50-200 pM dNTPs组成。KCl浓度高于50 mM可抑制Taq聚合酶，应避免使用。然而，KCl的存在是促使引物退火到模板DNA的必要条件。同样，PCR混合物中NaCl浓度过高会对Taq聚合酶的活性产生不利影响。MgCl2的最佳数量必须通过经验来确定。然而，大多数标准PCR可以使用1.5-2 mM MgCl2完成。对于一个典型的PCR, dNTPs的最终浓度是200 pM，但一些应用可以使用更低的浓度完成。较高浓度的dNTPs(或MgCl2)可促进Taq聚合酶与dNTP错配相关的错误，应避免。 The typical PCR mixture will include 0.2-1 pM of each oligonucleotide primer. The concentration of primers should not exceed 1 pM unless the primers employed contain a high degree of degeneracy. Taq polymerase is provided from the supplier at 5 U/pL. One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme required to catalyze the incorporation of 10 nmol of dNTP into acid-insoluble material in 30 min under standard reaction conditions. The amount of Taq polymerase included in a PCR will depend on the reaction size (20-50 pL). A 50-pL reaction will typically require 2.5 U of enzyme activity. The amount of DNA template included in a PCR will vary with the nature of the template source and the target sequence. Amplification from genomic DNA might require as much as 100 ng of DNA for a 50-pL reaction, whereas amplification from a plasmid template might only require 5 ng of DNA. Likewise, amplification of a target sequence that corresponds to a single allele might require more template, whereas amplification of a repetitive sequence (like Alu) will require substantially less template.

PCR混合物的各种成分可以在实验室中制备，也可以从商业来源购买。制备的反应缓冲液可用于Taq聚合酶(perkins - elmer Cetus或该酶的其他供应商)和其他耐热聚合酶。同样，商业准备的dNTP库存解决方案可以从几个来源购买。完整的PCR管内混合反应混合物可以购买，其中包含所有所需的PCR组分，除了DNA模板，寡核苷酸引物和Taq聚合酶(如EasyStart micro50 PCR管内混合反应，来自Molecular BioProducts，http://www.mbpinc.com/)．事实上，一些商业准备的PCR混合物以一种包括Taq聚合酶的形式提供(如Promega的PCR Master Mix，http://www.promega.com)，只需要添加寡核苷酸引物和DNA模板。这些商业化制备的反应混合物非常一致和可靠，它们适用于许多常规的PCR应用。

3.5.加入明胶或牛血清白蛋白(BSA)，其浓度可达100 |ag/mL，可提高聚合酶链反应的效率。这些试剂起作用稳定聚合酶。如果已知PCR的目标序列具有较高的G + C含量(27)，那么添加螺旋不稳定化学物质可能是必要的。例如，二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺或尿素可用于此目的。在大多数情况下，这些添加剂以10% (w/v或v/v)的比例包含在反应混合物中。这些添加剂被认为降低了目标序列的Tm。在聚合酶链反应中加入这些添加剂时必须小心，因为高浓度的这些化学物质会对聚合酶活性产生不利影响。例如，DMSO浓度超过10%可使Taq聚合酶活性降低50%。许多PCR混合物将包括非离子洗涤剂，如吐温-20,Triton X-100，或Nonident P40，浓度为0.05-0.1%。 The inclusion of these detergents can increase enzyme activity for certain polymerase preparations by preventing enzyme aggregation.

继续阅读:Pcr反应的优化

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