目标Vs信号放大

核酸可以使用靶点或信号放大方法. 短暂地目标放大酶可以增加目标分子的数量。简而言之，“一天结束时”，目标核酸的分子会更多。相反，信号放大不会增加靶点，而是使用高度敏感的报告分子或探针来检测靶点。例如，在信号放大中，一天结束时存在相同数量的分子，但分子方法充当一种“放大镜”，以帮助其“可视化”

2.1. 目标放大目标放大是最常用的方法，使用多种技术完成。靶向扩增通过采用酶体外复制步骤增加试管中传染源的核酸量。靶向扩增技术的例子有PCR、转录介导扩增（TMA）、核酸序列扩增（NASBA）、滚动循环扩增（RCA）、连接酶链式反应（LCR）和链置换扩增（SDA）。所有这些

图1：。等温一维靶或探针。

方法使用聚合酶或连接酶和短合成寡核苷酸作为引物。引物特异性结合在传染源中发现的互补序列。在大多数市面上可买到的试剂盒中，使用与扩增靶序列互补的第三个探针将额外水平的特异性添加到分析中。探头用于检测放大器。这些方法之间的主要区别在于使用多个温度与单个温度，以及目标或探针是线性还是圆形。

2.2. 等温放大等温方法的名称来源于拉丁语“iso”的意思相同或相似，希腊语“thermal（therme）”的意思是热。等温扩增可进一步细分为以一维线性核酸为靶点的方法和需要二维靶点或探针（即圆形分子）的方法。等温方法不需要热循环，这是这些方法的优点之一。此外，这些方法具有较高的吞吐量，因为所有步骤都可以在单管中执行。

2.2.1. 一维或线性目标/探针（TMA和NASBA）图1概述了TMA和NASBA放大方法（10,11）。这些技术最常见的核酸靶点是大量存在的核糖体RNA（rRNA）序列（例如，每个生物体超过10000个拷贝）。以这些核酸序列为靶点利用这些序列的天然多聚体拷贝。首先，合成具有RNA聚合酶结合序列和与靶rRNA互补区域的定制引物。该引物的区域在杂交时与rRNA序列互补，用作使用逆转录酶生成互补DNA（cDNA）分子的引物。RNase H活性降解rRNA靶标，留下单链cDNA。添加DNA聚合酶另一个互补DNA引物产生第二条链。最终产物产生原始rRNA序列的双链DNA（dsDNA）拷贝和RNA聚合酶结合区。RNA多聚酶的加入使该双链DNA作为模板，通过转录生成大量RNA分子（因此，称为转录介导扩增）。通过靶向高拷贝rRNA分子，而不是每个生物体1-2拷贝的DNA序列，每10000个rRNA将转化为能够产生大量RNA拷贝的转录活性DNA模板。最后，使用与放大器互补的探针来检测放大的序列。尽管rRNA序列通常是靶向的，但这种方法也可以用于其他RNA靶点，并且只需稍加调整，也可以用于DNA靶点。

2.2.2. 链置换扩增像TMA和NASBA一样，SDA需要多种酶（例如耐热聚合酶和限制性内切酶）（12-14）。

图2：。钢绞线位移放大。

图3：。滚动圆放大。

然而，相比之下，它需要以特定顺序（总共四个）的多个引物来扩增目标序列并置换复制的序列（图2）。另一个区别是它使用了化学修饰的脱氧核苷酸碱基（硫代dCTP）。放大过程分为两个阶段：目标生成阶段和放大阶段。在靶标生成阶段，一个含有限制性内切酶位点的工程引物与其互补靶标结合，并使用耐热聚merase启动链合成。保险杠引物取代含有限制性内切酶位点的引物产生的链。由于新生成的链含有硫代dCTP，因此它们不易受到限制性酶消化的影响。耐热限制性内切酶在双链分子中引入单链缺口。然后，耐热聚合酶延伸新链，从而将链3'置换到缺口处。最终，结合该限制性内切酶位点的新链将导致目标拷贝的指数级生成。

2.2.3. 二维或圆形目标/探头

图3描述了RCA复制机制。复制由单链缺口启动并开始

荧光素

图4：。（A） 连接酶链式反应；（B） 连接酶链式反应检测。

荧光素

图4：。（A） 连接酶链式反应；（B） 连接酶链式反应检测。

从缺口向上游延伸钢绞线，并继续延伸5’至3’。当新合成的链围绕圆形DNA分子滚动时，缺口3’或缺口下游的缺口链部分发生位移。结果是一条单链尾巴形成了初始圆的concatemeric单位。最后，由单链单元形成互补链。滚动圆复制形式用于单分子、单基点突变的灵敏检测和测序应用（15-25）。该方法也适用于在MDA中使用高保真度和高加工性聚合酶进行全基因组扩增（9）。该方法使用多个引物，这些引物与变性DNA结合，可以从0.3 ng起始材料中产生33000 ng DNA。这种方法已被证明能够以无偏的方式复制整个基因组序列。因此，丙二醛在为临床实验室生产大量稀有对照材料方面具有极其重要的价值。

继续阅读此处：多重热放大

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