Ouchterlony双扩散分析

当多克隆抗血清与蛋白质或多糖等大聚合抗原反应时,产生的交联通常会导致沉淀的形成。如果允许抗原和抗体通过琼脂相互扩散,沉淀物将以可见线的形式出现。这项技术是由Oudin和Ouchterlony独立开发的,但Ouchterlony技术更方便,因此更受欢迎(Silverstein,1989)。

典型分析如图9.1所示。在玻片(25 x 75 mm)上涂上3 ml熔融琼脂(1%磷酸盐缓冲盐水,pH 7.4),然后让琼脂凝固。或者,可以将凝胶倒在“Gelbond”柔性塑料板的亲水侧(FMC公司的海洋胶体部门)。Gelbond的使用可以在笔记本上记录永久的牢不可破的记录。冲孔直径为1-2 mm,通常在中心孔周围形成圆形图案。孔之间的距离通常为3-5 mm。

测试免疫球蛋白的最佳来源可能是克隆后获得的密集生长的杂交瘤细胞的培养上清液。这确保存在的唯一小鼠免疫球蛋白是所需抗体。由于同时存在正常免疫球蛋白,从血清或腹水中检测抗体等级可能会导致不明确的结果,尽管这些免疫球蛋白通常可以稀释。

当使用强抗免疫球蛋白血清时,Ouchterlony分析中检测免疫球蛋白的最佳浓度为100-1000 ng/ml。该浓度可通过将含有血清或腹水的杂交瘤抗体稀释约20倍来实现。培养液必须通过类似的因素进行浓缩。通过添加等体积的饱和硫酸铵(见第9.2.1节),然后离心并在适当体积的

Ouchterlony双扩散

图9.1。Ouchterlony(双扩散)单克隆抗体分析。这些井包含以下内容蛋白质(从顶部顺时针):IgClK、lgG2aX、IgGbic、lgG3X、IgAK和lgG3K。中央井包括antl-k(上两个面板)和anti-X(下两个面板)。两个右侧面板含有3%的聚乙二醇,而两个左侧面板不含有。可以看出,分型血清具有特异性,但lgG3X蛋白含有含K污染物。聚乙二醇的存在加强了右侧面板中的沉淀线。

图9.1。单克隆抗体的Ouchterlony(双扩散)分析。这些孔包含以下蛋白质(从顶部顺时针):IgClK、lgG2aX、IgGbic、lgG3X、IgAK和lgG3K。中央井包括antl-k(上两个面板)和anti-X(下两个面板)。两个右侧面板含有3%的聚乙二醇,而两个左侧面板不含有。可以看出,分型血清具有特异性,但lgG3X蛋白含有含K污染物。聚乙二醇的存在加强了右侧面板中的沉淀线。

磷酸盐缓冲盐水(PBS),隔夜对同一缓冲液透析以去除硫酸铵。

中央孔填充含有免疫球蛋白的溶液(通常为2-3 pi),外围孔填充未稀释的类特异性抗免疫球蛋白抗血清,可从许多商业供应商处获得。建议任何从事单克隆抗体生产的实验室都应拥有一套此类抗血清。允许扩散在室温下进行数小时。

强烈的“自制”类特异性抗免疫球蛋白抗体通常会在3-12小时内产生强烈的沉淀线,使用1.0 mg/ml的抗原。商用抗体通常较弱,似乎会“稀释”到可接受的最大稀释度,并且通常会超过该稀释度。它们通常应未经稀释使用,抗原应为100μg/ml左右。在这些条件下,12-18小时后应出现微弱的沉淀线。

如果像商用抗血清一样,反应太弱而不可见,则用考马斯蓝染色后,线可能会变得可见。在进行染色之前,必须去除未经处理的蛋白质。这可以通过将湿滑片浸泡在PBS中并搅拌1-2分钟来实现

天,但根据我的经验,琼脂通常会从载玻片上脱落。更好的方法是将载玻片包裹在用水湿润的Whatman 1号滤纸中,并在37°C下干燥过夜。大多数未折叠的蛋白质和缓冲盐将扩散到滤纸中。幻灯片干燥后,再次用水润湿纸张并将其取出。然后将载玻片在PBS中浸泡过夜,以使残留的未折叠蛋白质扩散出凝胶。然后将载玻片在0.1%考马斯蓝和40%甲醇:10%乙酸中染色5分钟,并在12%乙醇:7%冰醋酸中降解,直到背景合格。然后可在室温下将其干燥,以便永久记录。

有时即使染色后,沉淀线也很差。在倒入平板前向琼脂中添加3%(w/v)聚乙二醇(分子量4000-6000),通常会增强沉淀(图9.1)。

继续阅读此处:离子交换色谱法

这篇文章有用吗?

0 0