电压门控钙通道
在哺乳动物中，电压门控钙基因（Cav）的三个亚家族已被克隆：Cav1、Cav2和Cav3。Cav1和Cav2通常也被称为HVA通道，因为它们需要相对较高的膜去极化（>-30 mV）来激活（Hille，2001）。Cav3也被称为LVA通道，因为它们被较低的去极化（>-70 mV）激活。HVA Cav1亚家族（Cav 1.1-1.4）也称为L型钙通道，而HVA Cav2亚家族由P/Q（Cav2.1）、N（Cav2.2）和R（Cav2.3）组成。轴突中存在哪种类型的Cav通道？我们的重点是最近在哺乳动物轴突中的发现，尽管我们充分认识到，鱿鱼巨轴突中早就有Cav通道的描述。
有四种不同的方法被用来确定哺乳动物轴突上钙通道的存在。在第一种方法中，通过阻断钠通道和/或钾通道，可以揭示钙通道对动作电位波形的贡献。在第二种方法中，在免疫组织化学中使用亚型特异性抗体来确定某些Cav通道亚型的存在。在第三种方法中，研究了钙通道阻滞剂对缺血轴突的保护作用，由此推断出导致轴突损伤的钙通道亚型（Fern等人，1995a；Stys等人，1995）。在第四种也是最后一种方法中，Ca成像技术用于直接测量哺乳动物轴突中的活性依赖性钙内流。在最后一种方法中，由于作者目前的兴趣，Ca染料必须选择性地引入轴突，而不是周围的胶质细胞，因此在这里受到了更多的关注。我们的实验室开发了一种技术，使用一个紧密的吸液管通过视神经的切割端将Ca染料装载到数千个轴突柱中（图4A）（Verbny等人，2002年）。我们使用了一种葡聚糖共轭钙染料，可以显著增加其分子大小。这种染料在轴突Ca信号分析中有三个优点。首先，葡聚糖的大尺寸排除了胶质细胞染色，因为染料不能通过缝隙连接。其次，它可以更好地保留在轴突中。第三，右旋糖酐共轭钙染料具有较低的迁移率，可以更准确地分析空间钙信号（Gabso等人，1997）（Sabatini等人，2001）。图4B显示了使用该技术用Ca染料染色的轴突图像。一旦轴突装载了钙指示剂，并检测到活性依赖性钙内流，就可以根据亚型特异性毒素的良好可用性来识别各种Cav通道亚型。
图4哺乳动物视神经轴突钙荧光共焦成像。（A） 成像设置示意图。一块孤立的视神经被紧紧地吸进右侧的玻璃吸管中，吸管中充满了钙指示剂。钙指示剂扩散到轴突柱中。神经的另一端松松地被吸入玻璃刺激吸管中。在这种装置中，可以同时记录轴突钙离子和动作电位。（B） 钙指示剂染色的轴突代表性图像。条形图为20 | m。（经许可，转载自Zhang et al.，2004。）
图4哺乳动物视神经轴突钙荧光共焦成像。（A） 成像设置示意图。一块孤立的视神经被紧紧地吸进右侧的玻璃吸管中，吸管中充满了钙指示剂。钙指示剂扩散到轴突柱中。神经的另一端松松地被吸入玻璃刺激吸管中。在这种装置中，可以同时记录轴突钙离子和动作电位。（B） 钙指示剂染色的轴突代表性图像。条形图为20 | m。（经许可，转载自Zhang et al.，2004。）
本文总结了我们实验室在哺乳动物视神经上使用这种方法的结果。
1、N型Ca信道（Cav2.2）
在新生儿视神经轴突中检测到活动依赖性Ca瞬态（图5A，B）（Sun和Chiu，1999）。这些钙瞬变可通过去除外部钙可逆地消除，表明它们主要由钙内流引起，并被广谱Cav通道阻滞剂Cd和Ni阻断。约58%的Ca瞬变被raconotoxin GVIA阻断（图5C，左图），这是一种N型Cav特异性阻断剂，证明存在轴突N型Ca通道（Sun和Chiu，1999）。然而，由于L型钙通道阻滞剂以及P/Q特异性毒素（图5C，右图）不会影响钙瞬变，因此剩余钙瞬变的身份仍不清楚。有趣的是，巴氯芬对GABAB受体的激活导致新生儿视神经中N型钙瞬变的快速下调（图5A）（Sun和Chiu，1999）。轴突Ca信号的神经调节可能对病理轴突具有神经保护作用。Fern等人（1995b）证明，GABAb受体激活与代谢损伤期间的白质保护有关，很容易推测这种保护源于抑制N型钙通道。然而，成人有髓神经中是否存在N型钙通道尚不清楚（Brown等人，2001年）。如下文所述，N型钙通道在某些脱髓鞘模型的神经中上调。
2、L型钙通道
对成年哺乳动物白质进行的缺血研究表明，L型钙通道阻滞剂具有神经保护作用，表明L型钙通道存在于轴突上，并在缺血期间介导破坏性钙内流（Fern等人，1995a；Brown等人，2001；Quardouz等人。，
图5新生大鼠视神经中的N型钙通道。（A，B）使用图4所示的设置同时记录轴突钙瞬变（A）和动作电位（B）。注意钙和动作电位记录之间的时间尺度差异。巴氯芬可迅速减少钙瞬变（A），而不影响动作电位（B）。（C） 应用N型钙通道阻滞剂raconotoxin GVIA可阻断约58%的钙瞬变（左）。应用P型通道阻滞剂ra Aga IVA无效（右图）。注意，钙瞬变的巴氯芬敏感成分与raconotoxin GVIA敏感成分相同，表明N型钙通道与GABAB受体耦合。（经许可，修改自Sun and Chiu，1999。）
图5新生大鼠视神经中的N型钙通道。（A，B）使用图4所示的设置同时记录轴突钙瞬变（A）和动作电位（B）。注意钙和动作电位记录之间的时间尺度差异。巴氯芬可迅速减少钙瞬变（A），而不影响动作电位（B）。（C） 应用N型钙通道阻滞剂raconotoxin GVIA可阻断约58%的钙瞬变（左）。应用P型通道阻滞剂ra Aga IVA无效（右图）。注意，钙瞬变的巴氯芬敏感成分与raconotoxin GVIA敏感成分相同，表明N型钙通道与GABAB受体耦合。（经许可，修改自Sun and Chiu，1999。）
2003). 免疫组织化学表明，与钠通道不同，L型钙通道在轴突上的分布更为分散，且不局限于Ranvier的节点（Brown等人，2001）。最近的一项免疫组织化学研究表明，有髓轴突中的L型钙通道与ryanodine受体形成簇，这些通道受体簇介导缺血时细胞内钙的损伤性升高（Quardouz et al.，2003）。有趣的是，在新生儿视神经的Ca图像分析中，从药理学角度无法检测到L型Ca通道（Sun和Chiu，1999），这表明轴突L型Ca通道在髓鞘形成过程中上调。
3、配体门控钙通道
神经递质的各种受体与对Ca具有显著通透性的离子通道耦合。配体门控Ca通道在突触中具有广泛的特征，显著的例子是NMDA受体、AMPA受体和烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）。最近，在Ca成像研究中，已证实哺乳动物视神经轴突中存在nAChR受体（Zhang等人，2004）。在装有Ca指示剂的轴突中，bath应用尼古丁在轴突中诱导强烈的Ca升高（图6）。钙离子升高在清除沐浴钙后被消除，表明尼古丁诱导钙离子流入轴突。尼古丁反应被包括curare在内的各种nAChR拮抗剂阻断，表明Ca内流是受体介导的。此外，尼古丁会突然分流动作电位，这与轴突上阳离子nAChR的开放相一致。这些观察结果导致Zhang及其同事（Zhang et al.，2004）假设在神经细胞的轴突上存在功能性nAChR
图6新生小鼠视神经轴突上的钙通透性烟碱乙酰胆碱受体。根据图4A，轴突加载钙指示剂，并在（A）和（B）50 | M尼古丁浴前和后监测轴突的伪彩色钙图像。（C，D）根据A和B中的图像计算AF/F，显示逐像素的钙变化百分比。条形图为5 | m.（经许可，转载自Zhang et al.，2004。）
小鼠视神经。有趣的是，nAChR介导的钙反应随着视神经的成熟而下降，这表明髓鞘形成时轴突nAChR的下调或掩盖。在新生儿神经中，重复刺激会导致动作电位的curare敏感分流，这表明乙酰胆碱在重复活动期间释放（Zhang等人，2004）。部分活动依赖性轴突钙升高可能是由内源性乙酰胆碱释放.
继续阅读此处：钙通道在脱髓鞘疾病中的作用
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