转录激活子和抑制子
在真核细胞DNA中发现的各种转录控制元件是调节蛋白的结合位点。在本节中，我们将讨论这些转录因子的鉴定、纯化和结构，这些转录因子的功能是激活或抑制真核蛋白编码基因的表达。
足迹和凝胶位移分析检测蛋白质-DNA相互作用
在酵母、果蝇和其他遗传易驯化的真核生物中，许多编码转录激活子和抑制子的基因已经通过经典的遗传分析（如第9章所述）鉴定出来。然而，在哺乳动物和其他脊椎动物中，大多数转录因子都是最初检测到的，随后通过生化技术进行纯化，而哺乳动物和其他脊椎动物则不太适合这种遗传分析。在这种方法中，通过前一节所述的各种突变分析确定的DNA调节元件被用于确定与之特异结合的同源蛋白质。检测此类同源蛋白的两种常用技术是DNA酶I足迹法和电泳迁移率转移分析法。
DNA酶I足迹技术利用了这样一个事实，即当蛋白质与DNA区域结合时，它可以保护DNA序列不被核酸酶消化。如图11-13所示，当在有无DNA结合蛋白的情况下消化一端标记的DNA片段样品，然后变性、电泳，并对所得凝胶进行放射自显影时，受结合蛋白保护的区域在无蛋白质的情况下消化产生的条带阵列中显示为间隙或“足迹”。执行示意图时
^实验图11-13 DNA酶I足迹显示了控制元件序列，可用于转录因子纯化的分析。（a） DNA酶I足迹可以识别控制元件序列。已知含有控制元件的DNA片段一端用32P（红点）标记。然后，在存在和不存在被认为含有同源蛋白质的蛋白质样品的情况下，用DNase I消化部分标记的DNA样品。DNase I随机水解一个核苷酸脱氧核糖上的3'氧和下一个核苷酸的5'磷酸之间的DNA磷酸二酯键。使用低浓度的DNA酶I，使每个DNA分子平均只被切割一次（垂直箭头）。如果蛋白质样品不包含同源DNA结合蛋白，则DNA片段在原始片段的标记端和未标记端之间的多个位置被切割，如左侧的样品a所示。如果蛋白质样本包含同源蛋白质，如右侧的样本B，则蛋白质会与DNA结合，从而保护片段的一部分不被消化。DNA酶处理后，DNA从蛋白质中分离出来，变性以分离链，并进行电泳。所得凝胶的放射自显影术仅检测到标记链，并显示从标记端延伸到DNA酶I切割位点的片段。含有对照序列的切割片段显示在样品A的凝胶上，但在样品B中缺失，因为结合的同源蛋白阻止了该序列内的切割，从而产生相应的片段。凝胶上缺失的条带构成了足迹。（b） 含有序列特异性DNA结合蛋白的蛋白质组分可通过柱层析纯化。然后，DNA酶I足迹可以识别哪些洗脱组分含有同源蛋白。在没有添加蛋白质（NE，无提取物）的情况下，DNase I在多个位点切割DNA片段，在此处显示的凝胶上产生多条带。一种同源蛋白质，存在于核提取物应用于列（O，O nput）生成示意图。由于在流通蛋白组分（FT）中未检测到足迹活性，因此该蛋白与柱结合。在向色谱柱施加盐梯度后，大多数同源蛋白以组分9-12洗脱，缺失的条带（足迹）证明了这一点。蛋白质结合区的序列可以通过与在相同凝胶（M）上分析的已知长度的标记DNA片段进行比较来确定。[S.Yoshinaga等人，1989，J.Biol.Chem.264:10529（b）部分。]
对于含有已知DNA控制元件的DNA片段，脚印的出现表明存在一种转录因子，该转录因子结合所分析的蛋白质样品中的该控制元件。足迹还识别转录因子结合的特定DNA序列。
电泳迁移率偏移分析（EMSA），也称为凝胶偏移或条带偏移分析，在定量分析DNA结合蛋白方面比足迹分析更有用。一般来说，当DNA片段与蛋白质复合时，其电泳迁移率会降低，从而导致片段带位置的改变。该分析可用于检测与含有已知控制元件的放射性标记DNA片段孵育的蛋白质组分中的转录因子（图11-14）。
在转录因子的生化分离中，细胞核提取物通常会依次进行几种类型的柱层析（第3章）。使用含有已鉴定调控元件的DNA片段，通过DNA酶I脚印或EMSA对从柱中洗脱的部分进行分析（见图11-13和11-14）。在这些分析中，含有与调节元件结合的蛋白质的组分可能含有一种推测的转录因子。纯化转录因子的最后一步常用的一种强有力的技术是序列特异性DNA亲和层析，这是一种特殊类型的
分数ON1 2 S 4 S 6 7 8 9101112141618 20 22
绑定探测器-
自由探头
分数ON1 2 S 4 S 6 7 8 9101112141618 20 22
绑定探测器-
自由探头
► 实验图11-14电泳迁移率偏移分析可用于在纯化过程中检测转录因子。在此示例中，通过柱层析分离的蛋白质组分被分析其与含有已知调节元件的放射性标记DNA片段探针结合的能力。将一份等分的蛋白质样品装载到柱上（ON）和连续的柱部分（编号）与标记的探针一起孵育后，在不变性蛋白质的条件下对样品进行电泳。未与蛋白质结合的游离探针迁移到凝胶底部。将制备物中的一种蛋白质施加到柱上，并以7和8级分与探针结合，形成一种DNA-蛋白质复合物，其迁移速度比游离探针慢。因此，这些组分可能含有正在寻找的调节蛋白。[摘自S.Yoshinaga等人，1989年，《生物化学杂志》264:10529。]
亲和色谱法，将含有多个转录因子结合位点拷贝的长DNA链连接到柱状基质上。作为对分离蛋白事实上是转录因子的最终测试，其调节包含相应蛋白结合位点的模板转录的能力在体外转录反应中进行分析。图11-15显示了SP1的这种分析结果，SP1是一种与富含GC的序列结合的转录因子，从而激活附近启动子的转录。
▲ 实验图11-15可通过体外转录活性测定确定转录因子。SP1
根据其与SV40基因组中包含六个富含GC启动子近端元件拷贝的区域结合的能力进行鉴定，并通过柱色谱法进行纯化。为了测试纯化的SP1的转录激活能力，将其与模板DNA、含有RNA聚合酶II和相关一般转录因子的蛋白质组分以及标记的核糖核苷三磷酸在体外孵育。标记的RNA产物进行电泳和放射自显影。这里显示的是在SP1缺失（-）和存在（+）的情况下，腺病毒和SV40 DNA检测的放射自显影图。SP1对不含SP1结合位点的腺病毒启动子的转录没有显著影响。相反，SP1刺激SV40启动子的转录大约是10倍。[改编自M.R.Briggs et al.，1986，《科学》234:47。]
一旦一个转录因子被分离和纯化，它的部分氨基酸序列就可以被确定并用于克隆编码它的基因或cDNA，如第9章所述。然后可使用分离的基因在体内转染试验中测试编码蛋白激活或抑制转录的能力（图11-16）。
编码蛋白X的基因
ll质粒J]
报告基因转录本
▲ 实验图11-16体内转染分析测量转录活性，以评估被认为是转录因子的蛋白质。分析系统需要两个质粒。一个质粒含有编码假定转录因子（蛋白X）的基因。第二个质粒包含一个报告基因（如lacZ）和一个或多个蛋白X结合位点。两个质粒同时导入缺乏编码蛋白X基因的细胞。测量报告基因RNA转录物的产生；或者，可以分析编码蛋白质的活性。如果在X编码质粒存在的情况下报告基因转录更大，则该蛋白是一种激活剂；如果转录较少，则它是一种阻遏因子。通过使用编码突变或重排转录因子的质粒，可以识别蛋白质的重要结构域。
-
- 记者
报告基因转录本
激活剂是由不同功能域组成的模块化蛋白质
对一种名为GAL4的酵母转录激活剂的研究提供了对转录因子结构域的早期洞察。编码GAL4蛋白的基因可促进半乳糖代谢所需酶的表达，该基因通过对GAL4突变体的互补分析进行鉴定（第9章）。定向突变研究，如之前所述，确定了GAL4激活基因的UAS。这些UAS中的每一个都含有一个或多个被称为UASgal的相关17 bp序列的拷贝。用酵母GAL4基因在大肠杆菌中产生的重组GAL4蛋白进行DNA酶I足迹分析表明
GAL4蛋白与UASGAL序列结合。当在TATA盒上游克隆一个UAS-GAL拷贝，然后克隆一个lacZ报告基因时，lacZ在野生型细胞的半乳糖培养基中被激活，但在gal4突变体中没有激活。这些结果表明，UASGAL是半乳糖培养基中GAL4蛋白激活的转录控制元件。
对gal4缺失突变体的一组显著实验表明，gal4转录因子由可分离的功能域组成：一个N端DNA结合域，与特定DNA序列结合，另一个C端激活域，与其他蛋白质相互作用，以刺激附近启动子的转录（图11-17）。当GAL4的N末端DNA结合域直接融合到各种
（a） 报告基因构建lacZ基因盒
（b） 野生型和突变型GAL4蛋白
继续阅读此处：回顾概念
这篇文章有用吗？