探针标签
1、随机引物延伸
简并寡核苷酸引物由6-12个核苷酸组成，每个位置含有四种脱氧核苷三磷酸盐的每个组合，可在实验室制备（Sambrook等人，1989年）或商业购买。这种寡核苷酸引物非常异质，能够在用于探针的模板上的许多位置进行杂交。DNA聚合酶，添加了三个未标记的dNTP和一个a标记的dNTP。如果模板是单链DNADNA聚合酶I是选择的聚合酶。如果模板是单链RNA，则添加逆转录酶。可通过小型Sephadex G-50柱离心，从完成的探针混合物中去除任何未结合的前体。这一步骤通常是不必要的，因为近90%的标记核苷酸被纳入探针中（Sambrook等人，1989年）。
2、尼克翻译
将用作探针的双链DNA在胰腺DNase I的作用下被“刻痕”。添加大肠杆菌DNA聚合酶I、三个未标记的dNTP和一个标记的dNTP。DNA聚合酶I的5’->3’核酸外切酶活性从每个缺口的5’端开始去除核苷酸。当这发生时，3’-»5聚合酶活性这种酶的活性用游离dNTPs填补了不断扩大的空白，其中一些是放射性标记的（Sambrook等人，1989年）。
3、聚合酶链反应
标记的聚合酶链反应（PCR）产物可用作ISH探针。在此过程中，使用与探针序列两侧的载体序列互补的寡核苷酸引物。将Taq聚合酶、模板DNA以及标记和未标记的dNTPs添加到反应中，以产生标记探针（Sambrook et al.，1989）。
4、合成寡核苷酸
DNA合成器（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）可用于制备探针。该仪器使用T4多核苷酸激酶或末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的核苷酸添加到寡核苷酸末端。添加的核苷酸序列由机器操作员确定。生成的探针的长度通常为20-50个碱基。
5、万向联动系统
通用连锁系统（ULS）是一种非酶法DNA非同位素标记方法。铂衍生物是非放射性标记物（如生物素、地高辛）和DNA鸟嘌呤部分之间的连接物。腺嘌呤核苷酸的标记程度较低。据报道，这种方法可以产生高标记密度的探针（Jelsma和Hou thoff，1994）。
ISH使用了几个标签。最常见的放射性标签是32P、3H和35S。最常用的非放射性标签是生物素和地高辛。通过修改标准将生物素或地高辛纳入探针中尼克翻译公司程序随机引物法可用于标记这些分子，但缺口翻译通常产生较小的探针（Boyle，1990）。
在选择要纳入探头的标签类型时，应考虑每个标签的优缺点。早期的工作是使用放射性探针完成的，放射性探针仍然是判断其他标签的“金标准”。由于处理放射性同位素时必须遵守安全规定，以及非同位素探针所需的检测时间缩短，非同位素标签已变得很流行。
在放射性探针中，35S通常是首选。虽然35S的半衰期长于32P，但35S的分辨率更好。与3H相比，35S的分辨率较低，但其半衰期较短，需要约1周的曝光时间，而不是3H所需的数周。如“预混合”一节所述，使用35S时必须包括还原剂-标记探针（威尔金森，1992年）。最近有报道称，33P产生了良好的结果（McLaughlin和Margolskee，1993）。
在非同位素标记中，生物素是最常用的。如前所述，一些组织含有内源性生物素。虽然这个问题通常可以通过适当的控制来解决，但地高辛标记的探针正在被更频繁地使用。
杂交后，通过清洗去除未杂交的探针，并使用检测试剂。清洗的严格性非常重要：清洗必须足够严厉，以洗掉所有未混合的探针，而不会过于严厉，以至于真正的目标-探针混合体被摧毁。
正如在程序的预杂交部分中采取步骤以减少背景信号一样，在杂交后洗涤后可以加入许多步骤和试剂，以去除洗涤期间未去除的任何未杂交探针。如果探针是核糖探针，RNA酶可以用来降解任何剩余的单链探针。如果探针是DNA，则载玻片可能与硅核酸酶反应。这种DNA酶专门消化单链DNA。
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