亲脂性膜染料的命运图谱

亲脂性膜染料DiI是跟踪卵中相邻细胞的相对小群命运的首选染料。乍一看它很贵(100毫克190美元),但100毫克确实很有用。

DiI,像其他碳氰膜染料,如DiO和DiA(分子探针D-275和D-291),是亲脂性的,因此在应用到组织后,它很容易和优先扩散到细胞膜,而不是停留在细胞外水空间和扩散。

将DiI应用于组织的方法有很多种,其中大多数最初都需要将染料溶解在合适的溶剂中。建议第一次使用3mg DiI在1ml DMF中。如果你怀疑DMF对你的细胞有毒,DMSO或酒精可以作为替代溶剂。

3.1.1.胚胎的准备

在它们的侧面孵蛋。在蛋壳钝的一端打一个小针孔,就可以打开蛋壳了。这个窗口需要足够大,以使微管能够很容易地进入胚胎。在胚胎下面注入墨水。在要标记的胚胎的正上方的卵黄膜上开一个小洞,小心地在胚胎上加一小滴生理盐水,防止其干燥。使用酒精清洁的仪器和无菌溶液。

3.1.2.注射压力

这是将DiI应用于鸡胚组织的最传统方法。这是标记胚胎小区域内许多细胞的好方法,但不适用于分析邻近少量细胞的命运。虽然你可以使用喷嘴来控制染料的应用,但最好使用压力注入装置,如通用阀门公司(费尔菲尔德,新泽西州)制造的Picospritzer II。你还需要一个显微操作器,它牢固地附着在底板上或直接附着在用来观察胚胎的显微镜上。一个好的立体显微镜对精确定位胚胎组织是必不可少的。为了检查应用的准确性,最好使用配有长工作距离物镜的荧光显微镜。如果在每次使用时不检查染料沉积,那么在注射后立即牺牲一些胚胎是必要的,以便在固定和清除制剂中评估染料的最初扩散。染料通过微管抽拉器上的微管输送。作者使用直径1毫米,薄壁硼硅酸盐毛细管玻璃与内部灯丝,拉动这些毛细管,使移液管的尖端开口约1.5 pm。使用50 psi的压力和约5 ms的脉冲持续时间,可以从这些移液管中输送小的DiI等分(见注释1-4)。

3.1.3.电离子透入疗法

这是标记少量相邻细胞的最简单方法。它可以用来标记1到10个细胞。不建议将它作为标记许多细胞的方法。DiI是一种带电分子,因此可以通过在微管上施加电位差并将其用作微电极将其逐出微管。除了一个微管牵引器,良好的微操作器和立体显微镜,你所需要的是一个9 v电池。电池的负极应该与鸡蛋中的白蛋白相连。这很容易实现,只需将一根柔性电缆连接到一根细银线上,将银线插入鸡蛋开窗时在蛋壳上形成的孔中。正极通过电极夹连接到微电极的背面。通过1 M氯化锂溶液与电极尖端的Dil接触,该溶液被回填到电极中。作者通常使用一个电极的尖端直径为1.5 ^m的电极来标记神经板中的一些细胞,尽管亚微米尖端的电极也工作得很好。 The author uses 1.2-mm diameter, thin-walled borosilicate glass with internal filament. First insert the negative silver wire electrode into the albumin, and then manipulate the dye-laden microelectrode tip onto the cells to be labeled before completing the electrical circuit (see Note 4). Between 1 and 5 s of current are sufficient to label a few cells brightly (see Notes 5 and 6). The amount of dye expelled is very small and may not be visible without the aid of an epifluorescent microscope, but this technique is very effective and so can be confidently used without epifluorescence. Of course, if you want to check or measure exactly where the dye is deposited, an epifluorescent microscope with long working distance objective becomes essential.

3.1.4.作为固体的应用

用微管和微电极专门标记表层细胞(如外胚层)而不是深层细胞是很困难的,因为它们锋利的尖端很容易穿过表层细胞层。一种更好的方法是直接在表面细胞上处理小的DiI晶体。这可以通过首先将溶解的Dil再结晶到一个小玻璃棒的钝尖上,然后将这个玻璃棒接触到要标记的表面来实现。微型玻璃棒可以用微管小心地将其熔解并在小火焰中密封,或使用微锻炉。为了使染料重新结晶到针尖上,将一小滴溶解在DMF或酒精中的Dil滴在干净的塑料表面上,等待大部分溶剂蒸发掉。当溶液变得越来越浓缩和粘稠时,当你蘸入玻璃棒时,它就会简单地粘附在玻璃棒的尖端。轻轻操作装有迪尔的玻璃棒到细胞上,染料将重新溶解到细胞膜中。

3.1.5.固定,安装和查看

胚胎和染料的最大存活时间取决于细胞分裂稀释染料的速率。快速分裂细胞的命运可以很容易地研究长达3天,而非快速分裂系统至少可以研究一周。然后将胚胎固定在3.5%的多聚甲醛中,并将其保存在冰箱中直到观察。如果荧光细胞接近表面,该材料可以被视为一个完整的安装,或者它也可以被切片

图1所示。(A)鸡胚神经板中标记有DiI和DiA的细胞,并在离子电泳应用后立即观察。大约4个细胞被标记为DiI(红色),1个细胞被标记为DiA(绿色)。Bar是10 |im。(B)发育48小时后,标记为(A)的后代细胞仍然可见,两种颜色明显。Bar是50 |im。(C)运动神经元逆行标记周围神经在固定的组织。其中一条神经标记为DiI,相邻的神经标记为DiA。Bar是40 |im。(见第368页后面的色版2)

图1所示。(A)鸡胚神经板中标记有DiI和DiA的细胞,并在离子电泳应用后立即观察。大约4个细胞被标记为DiI(红色),1个细胞被标记为DiA(绿色)。Bar是10 |im。(B)发育48小时后,标记为(A)的后代细胞仍然可见,两种颜色明显。Bar是50 |im。(C)运动神经元在固定组织中从周围神经逆行标记。其中一条神经标记为DiI,相邻的神经标记为DiA。Bar是40 |im。(见第368页后面的色版2)

在恒温器或振动器上。为了增加组织的透明度,材料可以在含有2.5% DABCO的PBS中的90%甘油中清除。尽快观察和拍摄材料,以获得最佳效果。

3.1.6.双色命运映射

如果你想在同一个胚胎中直接检查两个细胞群的相对运动,那么每个细胞群都应该用不同颜色的染料进行标记。一个好的组合是用DiI标记一组,用DiA标记另一组(分子探针,cat。不。d - 291)。DiA在进入细胞膜后,在较宽的波长范围内发出荧光,但在绿色发射时强度最大。因此,使用适当的过滤器,它很容易与DiI的红色/橙色荧光区分开来(图1)。DiA的性能优于其他常用的绿色荧光染料DiO (Molecular Probes, cat)。不。D-275),因为它更容易溶解,离子载体更有效,荧光更强烈。

继续阅读:用亲脂膜染料荧光葡聚糖和辣根过氧化物酶HRP进行神经元示踪

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