记者转基因设计

当设计一个转基因报告结构时,仔细的计划是最重要的。转基因动物的生产和分析是劳动和时间密集型的,一个设计良好的结构将为你计划后续的实验提供一个良好的基础。尽管给定的报告的确切布局取决于实验的目标,但应该考虑到某些一般的考虑。下面将对此进行讨论。

3.1.1.一般考虑

1.报告基因需要像其他基因一样工作的能力。它必须包含宿主的转录、转录后和翻译机制所识别的所有结构元素,从而产生功能报告基因产物。

实验的主要目的是确定在发育过程中负责基因表达特定方面的控制序列,以重现内源性基因的确切表达模式。这提供了一个基线,可以从该基线定义控制该表达式的序列。如果之前没有关于调控元件的知识,最好从最大的可用DNA片段开始工作,从而最大限度地增加包含所有所需控制序列的机会。利用源自酵母(YAC)、细菌(BAC)或噬菌体P1 (PAC)的人工染色体载体的克隆策略,能够检测非常大(>100 kb)基因组区域的序列(10-12)。

2.一个设计良好的向量将被证明对您的报告的初始克隆和随后的分析都有很大的帮助。一些质粒载体,如pPolyIII(13),特别设计了大量的多个克隆位点,用于转基因结构的克隆和切除。然而,设计你自己的可能是有利的。

3.在微注射之前,报告基因片段需要从载体序列中分离出来(见注释1)。因此,构建物的两侧应该有独特的限制性内切酶位点。最常用的酶是NotI (8-bp识别序列),它是真核DNA中罕见的切割酶。其他合适的酶现已上市,如AscI、PacI、PmeI、SfiI和FseI (8-bp识别序列,New England Biolabs)或极其罕见的切割内含子编码内切酶(如I-SceI, 18-bp识别序列,Boehringer)。

4.尝试使用不包含lacZa区域的载体,因为我们已经发现,当尝试将lacZ基因插入这样的载体时,可能会出现高频率的重组问题(见注释2)。

5.某些真核DNA序列在克隆过程中可能会引起问题,引起高频率的重组事件。如果是这种情况,尝试切换到低拷贝数克隆载体,或切换到不同的细菌宿主菌株,因为这可能会规避问题(见注释3)。

6.当开发转基因实验来定义调控元素时,您无疑希望删除您的基本结构。包括合适的限制位点是有用的,这将允许使用外切酶III产生5'和3'嵌套缺失(14)。在分析的后期,您可能希望在特定的ds调节元素中引入点突变。利用载体进行位点定向突变而不需要亚克隆特定片段是一个好主意(15)。

3.1.2.完整的基因结构

研究基因调控的通常出发点要求转基因的结构组织尽可能接近内源基因的结构组织,从而允许调控元件的环境保持不变。由于这个原因,一个完整的基因结构通常被使用,在这个结构中,报告基因被插入到导致融合蛋白产生的基因编码序列中。或者,也可以创建双子转基因,其中报告子的翻译起始由病毒内部核糖体进入位点(IRES)序列介导(见注释4)。最好将报告子插入翻译起始密码子(ATG)处或尽可能靠近该密码子。如果你的基因产物具有已知的生物活性,这一点尤其重要,因为融合蛋白的过度表达可能会干扰转基因的调控或在转基因生物体中产生更广泛的生物效应。这些构造应该包含:

1.5'-侧翼序列,包括5'-非翻译区(5'-UTR),应该至少包含启动子活性的最小元素(通常位于转录起始位点的近端),使具有功能性翻译起始密码子(AUG)的mRNA能够产生。更远端的5'序列(有时上游的许多碱基)也可能包含重要的调控区域。

2.3’-序列中包含的元素指明了正确的转录终止和在mRNA的3’端添加poly(A)(见注释5)。某些基因的3’-非翻译区(3’-UTR)包括了编码mRNA的快速降解序列,可能必须删除这些序列才能获得令人满意的转基因活性水平(见注释6)。3’-转录调控区也可能存在。

3.基因内区域:内含子已被证明可以提高转基因活性的总体水平(16,17),并且在许多情况下,内含子包含转录调控元件。然而,对于功能报告基因产物的生产,并没有对剪接的绝对要求。有些基因的内含子序列对于适当的转录调控是不需要的,在某些情况下可能被省略。例如,在肌生成素基因的情况下(见图1),只有上游的侧翼序列对适当的转录调控是必要的(6)。

图1所示。(A,B)骨骼肌组织发育过程中肌原蛋白基因表达的动态进展。所示的胚胎,用X-gal染色p -半乳糖苷酶活性,来自一个携带细胞核定位lacZ报告基因的转基因系,在1.1 kb肌原蛋白5'侧序列的控制下(Ashby and P. W. J. R.,未发表数据;见参考文献6)。在11.5 dpc (A)时,可以在体中胚层的肌层部分看到强烈的染色条。到13.5 dpc (B)时,特定的肌肉块清晰可见。(C)在同一个胚胎中使用双报告基因。图示9.5 dpc胚胎后脑的冠状面(前面是最上面的)。p -半乳糖苷酶活性引起的蓝色染色源于lacZ基因在Hoxb-2增强子控制下的表达,Hoxb-2增强子在菱形体3和5中具有活性。第二种结构在Hoxb-2的增强子控制下包含碱性磷酸酶基因,该基因指导菱形球4的表达(显示为棕色染色)。图片由N. Collins和B. Singh (myogenin)和J. Sharpe (Hoxb-2)提供。 (See color plate 9 appearing after p. 368.)

图1所示。(A,B)骨骼肌组织发育过程中肌原蛋白基因表达的动态进展。所示的胚胎,用X-gal染色p -半乳糖苷酶活性,来自一个携带细胞核定位lacZ报告基因的转基因系,在1.1 kb肌原蛋白5'侧序列的控制下(Ashby and P. W. J. R.,未发表数据;见参考文献6)。在11.5 dpc (A)时,可以在体中胚层的肌层部分看到强烈的染色条。到13.5 dpc (B)时,特定的肌肉块清晰可见。(C)在同一个胚胎中使用双报告基因。图示9.5 dpc胚胎后脑的冠状面(前面是最上面的)。p -半乳糖苷酶活性引起的蓝色染色源于lacZ基因在Hoxb-2增强子控制下的表达,Hoxb-2增强子在菱形体3和5中具有活性。第二种结构在Hoxb-2的增强子控制下包含碱性磷酸酶基因,该基因指导菱形球4的表达(显示为棕色染色)。图片由N. Collins和B. Singh (myogenin)和J. Sharpe (Hoxb-2)提供。 (See color plate 9 appearing after p. 368.)

3.1.3.基本启动子的结构

1.一旦确定了特定的调控区域,它们就可以在一个更简单、基本的启动子结构上进行单独测试。序列可以在5'-和3'-上下文中和两种方向上进行测试。这将提供在缺乏其他元素的情况下内源基因表达模式的哪个子集可指定的信息,并测试增强子功能。这种结构的基本结构包括一个连接到报告基因(如lacZ/SV-40p(a))的最小启动子(见注释7),可以将假定的调控序列与之对应。为此目的使用最广泛的启动子如表1所示。

2.负调控区域可以在一个可以指导普遍表达或广泛表达的结构上进行测试,看看它们是否有能力限制这种模式。各种异源启动子已经被鉴定出来,可能适合于

表1

一些异源转基因启动子

的名字

大小,英国石油公司

笔记

参考文献。

最小的推动者

人p -球蛋白48

Hsp68a

Hoxb-4

HMGCR

小鼠热休克基因(hsp70.1)

老鼠Hoxb-4基因

HSV-TK

无处不在的推动者P-actin

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(-105 ~ +51)

鸡P-actin基因

小鼠羟甲基戊二酰辅酶a还原酶基因

老鼠Hoxa-7基因

12 cc

550 c

159 c

弱;包含6日18

TATA箱和启动元件;干净的强劲;在缺乏增强子的情况下,胚内无活性5,19,20

独立启动器;仅在上结肠中表达,仅在中脑异位表达22-25

无处不在的;内含子较大,包含1,26,27,人类启动子表达较强,胚胎普遍表达28,29;包含未翻译的外显子和内含子

在整个妊娠中期胚胎中表达一致

这一目的(见表1)。可能更可取的是在含有同源启动子的结构上测试这些区域。

表2

报告基因和底物

记者

细胞定位

形式

适宜性底物

参考文献。

ß牛乳糖

细胞质核

胞质膜

轴突运输

胞质膜(细胞外)

SV-40 T-Ag核定位信号融合到lacZ合成跨膜结构域融合到lacZ Tau(微管相关蛋白)融合到lacZ原生形态

所有基因所有基因

跨膜或分泌

轴突的表达

所有基因BCIP /电视台

并用lacZ双染色

31日,49岁,50岁

X-gal(浅蓝色或blo -gal(深蓝色)

尺码

(蓝紫)、BM紫(深紫)、NATP/快红RC(红)或NAGP/快蓝BN(绿)

3.1.4.报告基因的选择

1.有多种报告系统可供选择,其中的选择很大程度上取决于特定的实验目的和表达结构的细胞类型(见表2)。LacZ报告器可以靶向细胞质、细胞核和细胞骨架,或锚定在细胞膜上(31)。两种发色底物可与lacZ报告剂X-gal和Bluo-gal一起使用(见副标题3.4.1.)。

2.虽然lacZ通常是报告基因的选择,另一个选择是AP系统,它利用人类胎盘碱性磷酸酶基因(PALP-1: 32-34)。PALP-1具有许多属性,使其成为一种有用的转基因报告者:其cDNA很小(约2 kb,而lacZ为3.2 kb),很容易在哺乳动物细胞中表达。此外,人类AP蛋白对热处理的抵抗力是小鼠的100倍,而且有几种抑制小鼠AP活性的抑制剂不影响人类的酶(33)。AP有一系列基材可供选择,可得到不同颜色的产品(见表2)

其中,两个报告基因的表达可以在同一个胚胎中进行比较(见注释8和图1)。另一个潜在的有用应用是研究两个连锁基因的转录调控。在这种情况下,lacZ可以用来监测一个基因的表达,PALP-I可以用来监测另一个基因的表达,从而分析可能作用于一个或两个基因的元素。

3.来自维多利亚水母的绿色荧光蛋白(GFP)因其在体内基因表达和蛋白质定位的直接实时成像潜力而受到广泛关注(35-37)。绿色荧光蛋白已被成功应用于一系列生物体(38,39),尽管它在哺乳动物物种中的应用受到蛋白质表达水平和荧光强度两方面问题的阻碍。这些问题在一定程度上可能是由于热效应和形成GFP发色团所需的分子氧(40,41)。变异gfp的持续发展改变了光谱特性,改善了转录、翻译和翻译后特征,为这种多功能标记基因在哺乳动物系统中的成功带来了巨大希望(41-48)。荧光论坛是讨论绿色荧光蛋白和相关主题的一个有用论坛蛋白质新闻组,可通过USENET在bionet.molbio获得。蛋白质。荧光或通过万维网在http://www.bio.net/hypermail/荧光蛋白/。

继续阅读:克劳迪奥·D·斯特恩1介绍

这篇文章有帮助吗?

0 0